טכניקה סקווש צנורית וכמה לניתוח Cytological של יצירת זרע שימוש במודל עכבר
Summary
מטרת טכניקה זו סקווש צנורית הוא להעריך במהירות תכונות cytological של פיתוח העכבר spermatocytes תוך שמירה על תקינות הסלולר. שיטה זו מאפשרת הלימוד בכל שלבי יצירת זרע, ניתן ליישם בקלות לצד הביוכימי והמולקולרי ביולוגי גישות אחרות לצורך המחקר של העכבר מיוזה.
Abstract
התקדמות meiotic של הזכרים הוא תהליך הדורש פעולה מתואמת של מספר אירועים הסלולר בעלות רגולציה. שגיאות שאירעו במהלך המיוזה יכול להוביל פוריות, אובדן הריון או פגמים גנטיים. . מתחיל עם תחילת גיל ההתבגרות וממשיכים לאורך הבגרות, גלים סינכרונית למחצה רציפה של spermatocytes עוברים יצירת זרע, ובסופו של דבר להקים זרע הפלואידי. הגל הראשון של העכבר spermatocytes שעברו חניכה meiotic מופיעים ב יום 10 לכתיבה (10 dpp), משתחררים לתוך לומן של בקוריאנית וכמה כמו זרע בוגרת ב 35 dpp. לכן, זה יתרון כדי לנצל עכברים בתוך חלון הזמן התפתחותית זו כדי להשיג את אוכלוסיות מועשר עניין. ניתוח נדיר תא שלבים קשה יותר בעכברים בוגרים בשל תרומתה של גלים spermatogenic רצופים, אשר מגבירים את המגוון של אוכלוסיות סלולר בתוך בקוריאנית. השיטה המתוארת כאן היא טכניקה מיושמים בקלות על הערכה cytological של התאים המצויים על בקוריאנית וכמה עכברים, כולל spermatogonia, spermatocytes ו- spermatids. הטכניקה סקווש צנורית שומר על השלמות בתאי הנבט זכר מבודדת ומאפשרת בחינת מבנים הסלולר לא דמיינו בקלות עם טכניקות טיפול נוספות. כדי להדגים את היישומים האפשריים של טכניקה זו סקווש צנורית, פלך הרכבה היה בפיקוח spermatocytes להתקדם דרך prophase כדי מפה של שאני מעבר (מעבר G2/MI). בנוסף, שכפול centrosome, כרומוזום מין meiotic איון (MSCI) ואת היווצרות כרומוזום זר היו העריכו דוגמאות של המבנים cytological כי יכול להיות שנצפו בשיטה זו סקווש צנורית. טכניקה זו ניתן לאתר פגמים ספציפיים במהלך יצירת זרע שנגרמות על ידי מוטציה או ההפרעות אקסוגני, וכך, תורם להבנת מולקולרית יצירת זרע.
Introduction
מיוזה הוא אירוע הסלולר מורכב שבו סבב אחד של שכפול ה-DNA ואחריו שני כדורים רצופים של חלוקת התא. מספר אירועים ספציפיים מיוזה חייבת להיות מתואמת במהלך בשלבים הראשונים של מיוזה כדי להבטיח הפרדה בין כרומוזום מדויק. אירועים אלו כוללים השלמת רקומבינציה הומולוגית, כיוון משותף של אחותי kinetochores במהלך לליגת העל meiotic, ואובדן stepwise cohesin מתחמי כדי לפתור chiasmata בין homologs. ויסות מדויק של תהליכים אלה הוא הכרחי כדי לשמור על פוריות וכדי למנוע אירועים missegregation כרומוזום זה יכול להוביל גנטי הפרעות התפתחותיות והפלה ספונטנית1.
בזמן האירועים מפתח של מיוזה מתקיימים בזכרים ונקבות, הבדלים משמעותיים הטמפורלי, מכניסטית להתקיים בין יצירת זרע ו oogenesis2. לדוגמה, במהלך המיוזה הנשי, prophase מתרחשת במהלך התפתחות ואני מעצרים בשלב dictyate עד גיל ההתבגרות. לעומת זאת, יצירת זרע מתחילה גיל ההתבגרות ומתקדמת בגלים לאורך כל חיי הבוגרים ללא מעצר. ההבדלים בין זכר ונקבה מיוזה מדגישה את הצורך לפתח שיטות ייענו במיוחד לקראת הערכת תהליכים אלה, הן spermatocytes והן oocytes. כיום, הערכת התקדמות meiotic במידה רבה מסתמך על השימוש של כרומטין כפולות3,4,5. בעוד כרומטין כפולות הם שימושיים ללימוד כרומוזומים meiotic, הם נכשלים לשמר את שלמות הסלולר, מניעת הערכה של מבנים הסלולר כגון ציר microtubules, centrosomes, מעטפת הגרעין, טלומר קבצים מצורפים. חיים הדמיה, טכניקות culturing לטווח ארוך מאוד מתקדמת ההבנה שלנו של מיוזה נקבה; עם זאת, גישות דומות כדי להמחיש את כל התא ללא פגע, בתדירות נמוכה יותר מיושמות לחקר יצירת זרע6,7. על מנת להמחיש את האירועים דינמי במהלך המיוזה זכר, אנחנו הסתגלו צנורית הוקמה טכניקות סקווש להעריך במהירות את התכונות cytological של פיתוח העכבר spermatocytes8,9. השיטה המתוארת כאן שומר על שלמות התא, המאפשר לימוד מספר מבנים הסלולר בשלבים שונים של יצירת זרע.
טכניקה זו סקווש צנורית היא גישה כל התא, המאפשר להערכת מבנים הסלולר באמצעות מיקרוסקופ immunofluorescence. גישות נפוצות היסטולוגית להמחיש התקדמות meiotic בעכברים זכרים כגון haematoxylin ואאוזין מכתים של פרפין מוטבע האשכים, תיוג immunofluorescent של cryosections לאפשר סקירה רחבה של התקדמות meiotic. עם זאת, שיטות אלה להיכשל לפתור תאים בודדים במידה הנדרשת עבור ניתוח מפורט של האירועים המתרחשים במהלך המיוזה10,11. טכניקות חלופיות כדי לחזות תהליכים meiotic להסתמך על הפרעה chemiosmotic משמעותית spermatocyte כדי לבודד ולפתור חומרים גרעיניים3,4,5. טיפולים כימיים אלה לעכב את ההתבוננות סוגי תאים חוץ spermatocytes הראשי. שיטה תיאר לאחרונה על ידי Namekawa אפשרה את קהילת המחקר לשמר את הארכיטקטורה הגרעין של spermatocytes מבודדים, אך מחייב שימוש cytospin ואביזרים עשויים להיות לא זמינים כמה מעבדות4. לעומת זאת, הטכניקה סקווש צנורית רק דורש ציוד זה מקובל בדרך כלל במעבדות בביולוגיה ברוב של התא.
סקווש צנורית השיטה המתוארת כאן ניתן להמחיש את סוגי תאים מגוונים נמצא בתוך צנורית וכמה, כולל תאי סרטולי, spermatogonia, spermatocytes הראשיים והמשניים של spermatids. על ידי צימוד טכניקה זו עם הגל הראשון ליד סינכרוני של יצירת זרע בעכברים לנוער, זה ניתן לקבל מועשר אוכלוסיות של תאי spermatogenic כפי שהם התקדמות דרך מיוזה12. תהליך זה מאפשר ניתוח מפורט של תהליכי במהלך יצירת זרע, כגון אירועים prophase מוקדם, G2/MI מפה של מעברים “אנאפאזה”, spermiogenesis. יתר על כן, ההכנות סקווש צנורית ניתן להמחיש התכונות cytological של כרומוזומים (למשל interchromatid תחומים (ICDs) ו- kinetochores), centrosomes (centrioles ו- pericentriolar חומר/מטריצות). השיטה סקווש ניתן לבצע בקלות במקביל עם גישות אחרות, כגון כפולות כרומטין והפקת חלבונים. בנוסף, טכניקה זו שונתה בהצלחה להפקיד מתאים spermatogenic חיים בשקופיות עבור פריט חזותי ישיר13.
השיטה המתוארת כאן כרוכה טכניקה סקווש צנורית וכמה התא כולו כדי לנתח את המעבר G2/MI בעכברים C57BL/6J פראי-סוג. התכונות cytological של ראשי spermatocytes הזנת לליגת העל meiotic היו דמיינו מיקרוסקופ immunofluorescence להתבונן על ציר meiotic. טכניקה זו תכליתי ניתן לשנות בקלות לדמיין אחרים בשלבים meiotic, סוגי תאים שונים. הטכניקה היא גם נוטה אסטרטגיות ויזואליזציה חלופיים, כגון גישות DNA ו RNA דגים.
Protocol
Representative Results
Discussion
עכברים הוכיחו להיות אורגניזם מודל שימושי ללמוד את האירועים הסלולר המפקחים על התקדמות meiotic במהלך יצירת זרע. עוד יותר, הוא צורך לפתח כלים ששירתה המחקר של יצירת זרע כי אירועים רבים, כגון יציאה מן meiotic prophase אני, הם dimorphic מינית. פרוטוקול זה מתאר שיטה סקווש צנורית וכמה עבור ויזואליזציה ולימוד בשלב…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי NIGMS (R01GM11755) כדי P.W.J. על ידי מלגת גראנט ההדרכה מ הלאומי סרטן המכון (NIH) (CA009110) S.R.W., ג’יי-אייץ
Materials
| 16% Paraformaldehyde Aqueous | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 15710 | |
| 10x PBS | Quality Biological | 119-069-161 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| BSA | Sigma | A1470 | |
| Horse Serum | Sigma | H-1270 | |
| 35mm x 10mm Petri Dish, Sterile, non-treated | CellTreat | P886-229638 | |
| Poly-L-lysine coated glass slides | Sigma | P0425-72EA | |
| Liquid Blocker Pen | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 71310 | |
| Humid Box | Evergreen | 240-9020-Z10 | |
| Wheaton Coplin Glass Staining Dish for 5 or 10 Slides | Fisher | 08-813E | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Microscope Cover Slides (22mmx60mm) | Fisher | 12-544-G | |
| Clear Nail Polish | Amazon | N/A | |
| Microsopes | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SteREO Discovery.V8 | Zeiss | 495015-0001-000 | |
| Observer Z1 | Zeiss | 4109431007994000 | |
| Zeiss ZEN 2012 blue edition image software | Zeiss | ||
| ORCA-Flash 4.0 CMOS camera | Hamamatsu | ||
| Primary Antibodies | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse anti-SYCP3 | Santa Cruz | sc-74569 | 1 in 50 |
| Rabbit anti-SYCP3 | Fisher (Novus) | NB300-231 | 1 in 1000 |
| Goat anti-SCP3 | Santa Cruz | sc-20845 | 1 in 50 |
| Human anti-Centromere Protein | Antibodies Incorporated | 15-235 | 1 in 100 |
| Mouse anti-alpha tubulin | Sigma | T9026 | 1 in 1000 |
| Mouse anti-AIM1 | BD Biosciences | 611082 | 1 in 200 |
| Mouse anti-γH2AX | Thermo Fisher | MA1-2022 | 1 in 500 |
| Mouse anti-CENT3 | Abnova | H00001070-M01 | 1 in 200 |
| Rabbit anti-pericentrin | Abcam | ab4448 | 1 in 200 |
| Rabbit anti-REC8 | Courtesy of Dr. Karen Schindler | N/A | 1 in 1000 |
References
- Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nature Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).
- Morelli, M. A., Cohen, P. E. Not all germ cells are created equal: Aspects of sexual dimorphism in mammalian meiosis. Reproduction. 130 (6), 761-781 (2005).
- Sun, F., Handel, M. A. Regulation of the meiotic prophase I to metaphase I transition in mouse spermatocytes. Chromosoma. 117 (5), 471-485 (2008).
- Namekawa, S. H. Slide preparation method to preserve three-dimensional chromatin architecture of testicular germ cells. J Vis Exp. (83), e50819 (2014).
- La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis. Methods Mol Biol. 558, 279-297 (2009).
- Galdon, G., Atala, A., Sadri-Ardekani, H. In vitro spermatogenesis: how far from clinical application?. Curr Urol Rep. 17 (7), (2016).
- Staub, C. A century of research on mammalian male germ cell meiotic differentiation in vitro. J Androl. 22 (6), 911-926 (2001).
- Page, J., Suja, J. A., Santos, J. L., Rufas, J. S. Squash procedure for protein immunolocalization in meiotic cells. Chromosome Res. 6 (8), 639-642 (1998).
- Kotaja, N., et al. Preparation, isolation and characterization of stage-specific spermatogenic cells for cellular and molecular analysis. Nat Methods. 1 (3), 249-254 (2004).
- Xu, X., Xu, P. A modified cryosection method for mouse testis tissue. Tissue Cell. 33 (2), 208-210 (2001).
- Hess, R., Moore, B. Histological methods for evaluation of the testis. Methods Toxicol. 3 (Pt A), 52-85 (1993).
- Bellvé, A. R. Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells. Methods Enzymol. 225, 84-113 (1993).
- Ventela, S., Toppari, J., Parvinen, M. Intercellular organelle traffic through cytoplasmic bridges in early spermatids of the rat: mechanisms of haploid gene product sharing. Mol Biol Cell. 14 (July), 2768-2780 (2003).
- Bellvé, A. R., et al. Dissociation of the mouse testis and characterization of isolated spermatogenic cells. J Histochem Cytochem. 25 (7), 480-494 (1977).
- Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. J Histochem Cytochem. 59 (1), 6-12 (2011).
- Zickler, D., Kleckner, N. Recombination, pairing, and synapsis of homologs during meiosis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (6), 1-26 (2015).
- Hunter, N. Meiotic recombination: the essence of heredity. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (12), 1-36 (2015).
- Scherthan, H., et al. Centromere and telomere movements during early meiotic prophase of mouse and man are associated with the onset of pairing. J Cell Biol. 134 (5), 1109-1125 (1996).
- Zickler, D., Kleckner, N. The leptotene-zygotene transition of meiosis. Annu Rev Genet. 32, 619-697 (1998).
- Scherthan, H. A bouquet makes ends meet. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (8), 621-627 (2001).
- Turner, J. Meiotic sex chromosome inactivation. Development. 134 (10), 1823-1831 (2007).
- Royo, H., et al. ATR acts stage specifically to regulate multiple aspects of mammalian meiotic silencing. Genes Dev. 27 (13), 1484-1494 (2013).
- Turner, J. M., et al. Silencing of unsynapsed meiotic chromosomes in the mouse. Nat Genet. 37 (1), 41-47 (2005).
- Marjanović, M., et al. CEP63 deficiency promotes p53-dependent microcephaly and reveals a role for the centrosome in meiotic recombination. Nat Commun. 6, 7676 (2016).
- Inanç, B., Dodson, H., Morrison, C. G. A Centrosome-autonomous signal that involves centriole disengagement permits centrosome duplication in G2 phase after DNA damage. Mol Biol Cell. 21, 3866-3877 (2010).
- Firat-Karalar, E. N., Sante, J., Elliott, S., Stearns, T. Proteomic analysis of mammalian sperm cells identifies new components of the centrosome. J Cell Sci. 127 (Pt 19), 4128-4133 (2014).
- Fukuda, N., et al. The transacting factor CBF-A/Hnrnpab binds to the A2RE/RTS element of protamine 2 mRNA and contributes to its translational regulation during mouse spermatogenesis. PLoS Genet. 9 (10), e1003858 (2013).
- Lahn, B. T., et al. Previously uncharacterized histone acetyltransferases implicated in mammalian spermatogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (13), 8707-8712 (2002).
- Mermoud, J. E., Tassin, A. M., Pehrson, J. R., Brockdorff, N. Centrosomal association of histone macroH2A1.2 in embryonic stem cells and somatic cells. Exp Cell Res. 268 (2), 245-251 (2001).
- Shanmugam, M., Hernandez, N. Mitotic functions for SNAP45, a subunit of the small nuclear RNA-activating protein complex SNAPc. J Biol Chem. 283 (21), 14845-14856 (2008).
- Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460 (7252), 278-282 (2009).
- Kotaja, N., et al. Preparation, isolation and characterization of stage-specific spermatogenic cells for cellular and molecular analysis. Nat Methods. 1 (3), 249-254 (2004).
- Amory, J. K., et al. Suppression of spermatogenesis by bisdichloroacetyldiamines is mediated by inhibition of testicular retinoic acid biosynthesis. J Androl. 32 (1), 111-119 (2011).
- Hogarth, C. A., et al. Turning a spermatogenic wave into a tsunami: synchronizing murine spermatogenesis using WIN 18,446. Biol Reprod. 88 (2), 40 (2013).
- Yoshida, S., et al. The first round of mouse spermatogenesis is a distinctive program that lacks the self-renewing spermatogonia stage. Development. 133 (8), 1495-1505 (2006).
- Kluin, P. M., Kramer, M. F., Rooij, D. G. Spermatogenesis in the immature mouse proceeds faster than in the adult. Int J Androl. 5 (3), 282-294 (1982).
- Rodriguez, I., Ody, C., Araki, K., Garcia, I., Vassalli, P. An early and massive wave of germinal cell apoptosis is required for the development of functional spermatogenesis. EMBO J. 16 (9), 2262-2270 (1997).
- Kangasniemi, M., et al. Modulation of basal and FSH dependent cyclic AMP production in rat seminiferous tubules staged by an improved transillumination technique. Anat Rec. 227 (1), 62-76 (1990).
- Martianov, I., et al. Late arrest of spermiogenesis and germ cell apoptosis in mice lacking the TBP-like TLF/TRF2 gene. Mol Cell. 7 (3), 509-515 (2001).
- Henriksén, K., Parvinen, M. Stage-specific apoptosis of male germ cells in the rat: Mechanisms of cell death studied by supravital squash preparations. Tissue Cell. 30 (6), 692-701 (1998).
