Eine Seminiferous Röhrchen-Squash-Technik für die zytologische Analyse der Spermatogenese mit dem Maus-Modell

Meiose ist ein komplexes zellulären Ereignis, in dem eine einzelne Runde der DNA-Replikation von zwei aufeinander folgenden Runden der Zellteilung gefolgt. Meiose-spezifische Veranstaltungen müssen während der Anfangsphase der Meiose zu gewährleisten genaue Chromosom Abtrennung koordiniert werden. Diese Ereignisse gehören der Abschluss der homologen Rekombination, Co Ausrichtung der Schwester Kinetochore während die erste meiotische Teilung und der schrittweise Verlust der Cohesin-komplexe, Chiasmata zwischen homologen zu lösen. Präzise Regulation dieser Prozesse ist notwendig, um die Fruchtbarkeit zu erhalten und Chromosom Missegregation Ereignisse zu verhindern, die zu genetischen Entwicklungsstörungen und spontanen Fehlschlag¹führen können.

Während die wichtigsten Ereignisse der Meiose in Männchen und Weibchen stattfinden, bestehen erhebliche zeitliche und mechanistische Unterschiede zwischen Spermatogenese und Oogenese². Zum Beispiel, während der weibliche Meiose, Prophase I tritt während der Embryonalentwicklung und Verhaftungen in der Dictyate-Phase bis zur Pubertät. Im Gegensatz dazu beginnt Spermatogenese um Pubertät und schreitet in Wellen im gesamten Erwachsenenlebens ohne Haftbefehl. Die Unterschiede zwischen männlichen und weiblichen Meiose betont die Notwendigkeit, Methoden zu entwickeln, die speziell zur Beurteilung dieser Prozesse in Spermatozyten und Eizellen gesorgt werden. Derzeit beruht weitgehend meiotic Progression Beurteilung auf der Verwendung von Chromatin breitet sich^3,4,5. Während Chromatin breitet sich nützlich für das Studium meiotische Chromosomen sind, Scheitern sie Erhaltung zellulären Integrität, Bewertung von Zellstrukturen wie Spindel Mikrotubuli, Zentrosomen, die Kernhülle und Telomere Anlagen zu verhindern. Live imaging und langfristigen Kultivierung Techniken haben unser Verständnis der weibliche Meiose stark fortgeschritten; ähnliche Konzepte für die gesamte intakten Zelle zu visualisieren sind jedoch weniger häufig für die Untersuchung der Spermatogenese^6,7implementiert. Um dynamische Ereignisse in der gesamten männlichen Meiose zu visualisieren, haben wir etablierte Röhrchen Squash Techniken um schnell beurteilen die zytologischen Merkmale entwickeln Maus Spermatozyten^8,9angepasst. Die hier beschriebene Methode bewahrt die Integrität der Zelle ermöglicht die Untersuchung von mehreren Zellstrukturen während der verschiedenen Phasen der Spermatogenese.

Diese Röhrchen-Squash-Technik ist eine ganze Zelle Ansatz, der für die Beurteilung der Zellstrukturen durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie ermöglicht. Gemeinsamen histologischen Ansätze zur meiotic Progression bei männlichen Mäusen wie Hämatoxylin und Eosin Färbung von Paraffin eingebettet Hoden und immunofluorescent Kennzeichnung von Cryosections visualisieren ermöglichen einen umfassenden Überblick über die meiotische fortschreiten. Aber nicht diese Techniken, Einzelzellen, soweit dies zur detaillierten Analyse der Ereignisse in der gesamten Meiose^10,11zu lösen. Alternative Techniken meiotische Prozesse visualisieren beruhen auf bedeutende chemiosmotischen Unterbrechung der Spermatocyte zu isolieren und beheben von nuklearem Material^3,4,5. Diese chemischen Behandlungen behindern die Beobachtung der Zelltypen als primären Spermatozyten. Eine kürzlich beschriebene Methode durch Namekawa ermöglichte die Forschungsgemeinschaft, die nukleare Architektur des isolierten Spermatozyten zu bewahren, aber erfordert den Einsatz von einem Cytospin und Accessoires, die möglicherweise nicht ohne weiteres zur Verfügung stehen einige Labors⁴. Im Gegensatz dazu erfordert die Röhrchen Squash Technik nur Geräte, die in der Regel standard in den meisten Zelle Biologie Labors.

Die hier beschriebene Röhrchen Squash-Methode lässt sich die unterschiedlichen Zelltypen gefunden innerhalb der seminiferous Röhrchen, einschließlich Sertoli-Zellen, Spermatogonien, primäre und sekundäre Spermatozyten und Spermatids visualisieren. Durch die Kopplung dieser Technik mit der in der Nähe von synchronen erste Welle der Spermatogenese bei jungen Mäusen, ist es möglich, angereicherte Populationen von spermatogenic Zellen zu erhalten, wie sie durch Meiose^{12 Fortschritte}. Dieses Verfahren ermöglicht die detaillierte Analyse der Prozesse innerhalb der gesamten Spermatogenese, wie frühe Prophase Ereignisse, die G2/MI und Metaphase Anaphase Übergänge und Spermiogenesis. Darüber hinaus können Röhrchen Squash Vorbereitungen zur zytologischen Merkmale der Chromosomen (z. B. interchromatid Domains (ICD) und Kinetochore) und Zentrosomen (Centriolen und Pericentriolar Material/Matrizen) zu visualisieren. Die Squash-Methode kann ohne weiteres parallel andere experimentelle Ansätze, wie z.B. Chromatin Spreads und Proteingewinnung durchgeführt werden. Darüber hinaus wurde diese Technik erfolgreich geändert spermatogenic Frischzellen auf Folien für direkte Visualisierung¹³zu hinterlegen.

Die hier beschriebene Methode beinhaltet eine ganze Zelle seminiferous Röhrchen Squash Technik um den G2/MI Übergang in Wildtyp C57BL/6J Mäuse zu analysieren. Die zytologischen Merkmale des primären Spermatozyten betreten die erste meiotische Teilung wurden mit Immunfluoreszenz-Mikroskopie, beobachten die meiotische Spindel visualisiert. Dieses vielseitige Technik kann leicht geändert werden, um andere meiotische Stufen und verschiedene Zelltypen zu visualisieren. Die Technik ist auch offen für alternative Visualisierung Strategien, wie DNA und RNA Fisch Ansätze.