Een Seminiferous zaadvormende Squash techniek voor de cytologische analyse van de spermatogenese met behulp van het muismodel

Meiose is een complexe cellulaire evenement waarin een ronde van DNA-replicatie wordt gevolgd door twee opeenvolgende ronden van de celdeling. Verschillende meiose-specifieke gebeurtenissen moet tijdens de eerste stadia van meiose om ervoor te zorgen nauwkeurige chromosoom segregatie gecoördineerd zijn. Deze gebeurtenissen omvatten de voltooiing van homologe recombinatie, mede richting van zuster kinetochoren tijdens de eerste Meiotische klasse, en de stapsgewijze verlies van cohesin complexen op te lossen chiasmata tussen homologen. Precieze regulatie van deze processen is noodzakelijk om vruchtbaarheid en ter voorkoming van chromosoom missegregation gebeurtenissen die tot genetische ontwikkelingsstoornissen en spontane miskraam^{1 leiden kunnen}.

Terwijl de belangrijkste gebeurtenissen van meiose in zowel mannen als vrouwen plaatsvindt, bestaan temporele en mechanistische verschillen tussen spermatogenese en ooegenese². Bijvoorbeeld, tijdens de vrouwelijke meiose, profase I optreedt tijdens de embryonale ontwikkeling en arrestaties in het stadium van de dictyate tot de puberteit. Daarentegen begint spermatogenese bij puberteit en vordert in golven hele volwassen leven zonder arrestatie. De verschillen tussen mannelijke en vrouwelijke meiose benadrukt de noodzaak tot het ontwikkelen van methoden die specifiek naar de beoordeling van deze processen in oöcyten en spermatocyten worden verzorgd. Op dit moment afhankelijk beoordelen Meiotische progressie grotendeels van het gebruik van chromatine spreads^3,4,5. Terwijl chromatine spreads nuttig zijn voor het bestuderen van Meiotische chromosomen, verzuimen om cellulaire integriteit, voorkomen van evaluatie van cellulaire structuren zoals spindel microtubuli, centrosomes, de nucleaire envelop en telomeer bijlagen te behouden. Wonen beeldvorming en op lange termijn kweken technieken hebben zeer geavanceerde ons begrip van vrouwelijke meiose; soortgelijke benaderingen te visualiseren de hele intact cel, zijn echter minder vaak geïmplementeerd voor de studie van de spermatogenese^6,7. Om te visualiseren dynamische gebeurtenissen in de gehele mannelijke meiose, hebben we aangepast gevestigde zaadvormende squash technieken om te snel beoordelen de cytologische functies muis spermatocyten^8,9te ontwikkelen. De hier beschreven methode onderhoudt de integriteit van de cel, de studie van meerdere cellulaire structuren inschakelen tijdens verschillende stadia van de spermatogenese.

Deze zaadvormende squash techniek is een benadering van de hele cel, die het mogelijk voor de beoordeling van cellulaire structuren via immunofluorescentie microscopie maakt. Gemeenschappelijke histologische benaderingen te visualiseren Meiotische progressie in mannelijke muizen zoals haematoxylin en eosine kleuring van paraffine ingesloten testes en immunefluorescentie labeling van cryosecties is voorzien van een breed overzicht van Meiotische progressie. Echter deze technieken niet om te zetten in afzonderlijke cellen voorzover nodig voor de gedetailleerde analyse van de gebeurtenissen die zich tijdens de meiose^10,11. Alternatieve technieken om te visualiseren Meiotische processen is afhankelijk van de verstoring van de belangrijke chemiosmotic om de spermatocyte te isoleren en oplossen van kernmateriaal^3,4,5. Deze chemische behandelingen een belemmering vormen voor de waarneming van celtypes dan primaire spermatocyten. Een recent beschreven methode door Namekawa de onderzoekgemeenschap voor het behoud van de nucleaire architectuur van geïsoleerde spermatocyten heeft ingeschakeld, maar vereist het gebruik van een cytospin en accessoires die niet mag beschikken sommige laboratoria⁴. In tegenstelling, vereist de zaadvormende squash techniek alleen apparatuur die over het algemeen standaard is in de meeste cel biologie laboratoria.

De zaadvormende squash hier beschreven methode kan worden gebruikt om de verschillende celtypen gevonden binnen de seminiferous zaadvormende, met inbegrip van de sertoli-cellen, spermatogonia, primaire en secundaire spermatocyten en spermatids te visualiseren. Door deze techniek te koppelen met de in de buurt van de synchrone eerste golf van de spermatogenese bij jonge muizen, is het mogelijk te krijgen verrijkt populaties in cellen als zij vooruitgang door middel van meiose¹². Dit proces staat een gedetailleerde analyse van processen in de gehele spermatogenese, zoals vroege profase gebeurtenissen, de G2/MI en de metafase, anafase overgangen en spermiogenesis. Bovendien kunnen zaadvormende squash preparaten worden gebruikt om te visualiseren cytologische kenmerken van de chromosomen (b.v. interchromatid domeinen (ICDs) en kinetochoren) en centrosomes (centrioles en pericentriolar materiaal/matrices). De squash-methode kan gemakkelijk worden uitgevoerd in parallel met andere experimentele benaderingen, zoals chromatine spreads en eiwit extractie. Bovendien is deze techniek met succes gewijzigd om te storten van levende in cellen op dia’s voor directe visualisatie¹³.

De hier beschreven methode omvat een hele cel seminiferous zaadvormende squash techniek voor het analyseren van de overgang van G2/MI in wild-type C57BL/6J muizen. De cytologische kenmerken van primaire spermatocyten invoeren de eerste Meiotische klasse werden gevisualiseerd met immunofluorescentie microscopie te observeren de Meiotische spindel. Deze veelzijdige techniek kan eenvoudig worden aangepast om te visualiseren andere Meiotische etappes en de verschillende soorten cellen. De techniek is ook vatbaar voor alternatieve visualisatie strategieën, zoals DNA en RNA vis benaderingen.