تقنية إسكواش أنبوب سيمينيفيروس لتحليل الحيوانات المنوية باستخدام نموذج الماوس الخلوية
Summary
والهدف من هذا الأسلوب الاسكواش أنبوب سرعة تقييم ميزات الخلوية النامية spermatocytes الماوس مع الحفاظ على سلامة الخلوية. هذا الأسلوب يسمح للدراسة لجميع المراحل من الحيوانات المنوية، ويمكن تنفيذها بسهولة جنبا إلى جنب مع النهج البيولوجية الجزيئية والكيمياء الحيوية الأخرى لدراسة الانقسام الاختزالي الماوس.
Abstract
التدرج هو لدى الذكور هو عملية تتطلب العمل المتضافر لعدد من الأحداث الخلوية عالية التنظيم. يمكن أن تؤدي الأخطاء التي تحدث أثناء الانقسام الاختزالي للعقم، وفقدان الحمل أو العيوب الوراثية. تبدأ بداية البلوغ والمستمرة طوال مرحلة البلوغ، موجات شبه متزامن المستمر من spermatocytes الخضوع للحيوانات المنوية والحيوانات المنوية فرداني تشكل في نهاية المطاف. الموجه الأولى من سبيرماتوسيتيس الماوس يمر هو بدء يظهر في اليوم العاشر بعد الولادة (10 مدير النيابة العامة) وهي التي تطلق في التجويف الخصي كالحيوانات المنوية الناضجة في النيابة العامة 35. ولذلك، من المفيد استخدام الفئران داخل هذا الإطار الزمني الإنمائية بغية الحصول على السكان المخصب بدرجة عالية من الاهتمام. تحليل لمراحل الخلية نادرة أكثر صعوبة في الفئران الأكبر سنا نظراً لمساهمة المتعاقبة spermatogenic، التي تزيد من تنوع السكان الخلوية داخل الأنابيب. الأسلوب الموصوفة هنا أسلوب سهل تنفيذ للتقييم الخلوية للخلايا الموجودة داخل الخصي في الفئران، بما في ذلك سبيرماتوجونيا، سبيرماتوسيتيس، ولوحظت. تقنية الاسكواش يحافظ على سلامة الخلايا الجرثومية الذكور المعزولة ويسمح فحص الهياكل الخلوية التي لا يتم تصور بسهولة مع التقنيات الأخرى. إظهار التطبيقات الممكنة لهذه التقنية الاسكواش أنبوب، رصد الجمعية المغزل في spermatocytes تتقدم من خلال الطور الأول الطورية وأنا تمر بمرحلة انتقالية (G2/مي الانتقال). وبالإضافة إلى ذلك، تم تقييم centrosome الازدواجية، وهو الجنس كروموسوم المنظمة (مورجان ستانلي)، وتشكيل باقة كروموسوم كأمثلة على الهياكل الخلوية التي يمكن ملاحظتها باستخدام هذا الأسلوب للاسكواش أنبوب. يمكن استخدام هذا الأسلوب لتحديد العيوب المحددة خلال الحيوانات المنوية التي تنتج عن الطفرات أو اضطراب خارجية، وهكذا، يساهم في فهمنا الجزيئية للحيوانات المنوية.
Introduction
الانقسام هو حدث خلوية معقدة التي تبعتها جولة واحدة من تكرار الحمض النووي هما جولات متعاقبة من انقسام الخلية. يجب أن يكون العديد من الأحداث الخاصة بالانقسام الاختزالي منسقة خلال المراحل الأولية من الانقسام الاختزالي ضمان الفصل بين كروموسوم دقيقة. تتضمن هذه الأحداث إنجاز مثلى جزئ، التوجه المشترك للأخت كينيتوتشوريس خلال شعبة هو الأول، وفقدان تدريجي لمجمعات كوهيسين لحل تشياسماتا بين هومولوجس. التنظيم الدقيق لهذه العمليات ضروري للحفاظ على الخصوبة ومنع كروموسوم ميسيجريجيشن الأحداث التي يمكن أن تؤدي إلى اضطرابات النمو الوراثية والإجهاض العفوي1.
بينما الأحداث الرئيسية للانقسام الاختزالي تحدث في الذكور والإناث على السواء، وتوجد فوارق هامة الزمانية والميكانيكية بين الحيوانات المنوية وتكون البويضات2. على سبيل المثال، أثناء الانقسام الاختزالي الإناث، الطور الأول يحدث خلال التطور الجنيني، والاعتقالات في مرحلة ديكتياتي حتى سن البلوغ. وفي المقابل، تبدأ الحيوانات المنوية في سن البلوغ وتقدم في موجات طوال حياة البالغين دون القبض عليه. الفروق بين الذكور والإناث في الانقسام الاختزالي تشدد على الحاجة إلى تطوير أساليب تلبي على وجه التحديد إلى تقييم هذه العمليات في كل من سبيرماتوسيتيس وبويضات. في الوقت الراهن، تقييم التقدم هو إلى حد كبير يعتمد على استخدام لونين ينتشر3،،من45. في حين ينتشر الكروماتين مفيدة لدراسة الكروموسومات هو، فشلوا في الحفاظ على سلامة الخلوية، منع تقييم الهياكل الخلوية مثل المغزل microtubules، سينتروسوميس، والمغلف النووية، والمرفقات telomere. يعيش التصوير وتقنيات تثقيف طويلة الأجل قد متقدمة إلى حد كبير فهمنا للانقسام الاختزالي الإناث؛ نهج مماثل لتصور الخلية سليمة بأكملها، ومع ذلك، تنفذ أقل كثيرا لدراسة الحيوانات المنوية6،7. من أجل تصور الأحداث الحيوية في جميع أنحاء الانقسام الذكور، نحن قد تكيفت أنبوب المنشأة الاسكواش تقنيات لتقييم سرعة الخلوية ميزات وضع الماوس سبيرماتوسيتيس8،9. الأسلوب الموصوفة هنا يحافظ على وحدة الخلية، مما يتيح دراسة الهياكل الخلوية متعددة خلال المراحل المختلفة للحيوانات المنوية.
هذا الأسلوب للاسكواش أنبوب هو نهج خلية كاملة، مما يسمح لتقييم الهياكل الخلوية عن طريق الفحص المجهري الفلورة. تسمح نهج النسيجي مشتركة لتصور التقدم هو في الفئران الذكور مثل هايماتوكسيلين وتلطيخ ويوزين الخصيتين البارافين المضمنة، ووسم إيمونوفلوريسسينت من كريوسيكشنز لمحة عامة عن التقدم هو. ومع ذلك، تفشل هذه التقنيات لحل الخلايا المفردة بالقدر اللازم لتحليل مفصل للأحداث التي وقعت في جميع أنحاء الانقسام الاختزالي10،11. تقنيات بديلة لتصور العمليات هو الاعتماد على انقطاع تشيميوسموتيك كبيرة سبيرماتوسيتي عزل وإصلاح المواد النووية3،،من45. هذه العلاجات الكيميائية تعوق مراقبة أنواع الخلايا عدا spermatocytes الأولية. وصف مؤخرا أسلوباً ناميكاوا مكن مجتمع البحوث للحفاظ على بنية النووية spermatocytes معزولة، ولكن يتطلب استخدام سيتوسبين والملحقات التي قد لا تكون متاحة لبعض المختبرات4. وفي المقابل، يتطلب تقنية الاسكواش أنبوب فقط المعدات القياسية عموما في معظم مختبرات البيولوجيا الخلية.
يمكن استخدام أنبوب الاسكواش الطريقة الموضحة هنا لتصور أنواع الخلايا المتنوعة الموجودة داخل أنبوب سيمينيفيروس، بما في ذلك خلايا سيرتولي، سبيرماتوجونيا، سبيرماتوسيتيس الأولية والثانوية، ولوحظت. باقتران هذا الأسلوب مع الموجه الأولى قرب متزامن للحيوانات المنوية في الفئران الأحداث، من الممكن الحصول على السكان المخصب spermatogenic الخلايا كما أنها تقدم من خلال الانقسام الاختزالي12. تسمح هذه العملية تحليل مفصل للعمليات في جميع أنحاء الحيوانات المنوية، مثل أوائل الطور الأول الأحداث G2/مي والطوريه للتحولات طور الصعود، وسبيرميوجينيسيس. علاوة على ذلك، يمكن استخدام أنبوب الاسكواش الاستعدادات لتصور الخلوية ميزات الكروموسومات (مثل مجالات إينتيرتشروماتيد (مستودعات التخليص الداخلي) وكينيتوتشوريس) وسينتروسوميس (centrioles والمواد بيريسينتريولار/المصفوفات). يمكن تنفيذ أسلوب الاسكواش سهولة بالتوازي مع نهج تجريبية أخرى، مثل حيزات الكروماتين واستخراج البروتين. وبالإضافة إلى ذلك، هذا الأسلوب تم تعديل بنجاح لإيداع spermatogenic الخلايا الحية على الشرائح للتصور المباشرة13.
الأسلوب الموصوفة هنا ينطوي على تقنية إسكواش أنبوب seminiferous خلية كاملة لتحليل الانتقال G2/مي في البرية من نوع C57BL/6J الفئران. كانت تصور ملامح الخلوية الأولية spermatocytes دخول شعبة هو أول مع مجهر الفلورة لمراقبة محور الدوران هو. يمكن تعديل هذه التقنية متعددة بسهولة لتصور هو مراحل وأنواع مختلفة من الخلايا الأخرى. هذه التقنية أيضا قابلة لاستراتيجيات التصور البديلة، مثل النهج الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي الأسماك.
Protocol
Representative Results
Discussion
الفئران أثبتت أن يكون كائن نموذج مفيد لدراسة الأحداث الخلوية التي تحكم تطور هو خلال الحيوانات المنوية. علاوة على ذلك، فإنه من الضروري تطوير الأدوات التي تهتم بدراسة الحيوانات المنوية لأن العديد من الأحداث، مثل الخروج من الطور الأول هو أنا، ديمبرافيك جنسياً. هذا البروتوكول وصف أسلوب إسكو?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نيجمس (R01GM11755) إلى P.W.J. وزمالة منحة تدريبية من الوطنية سرطان معهد (NIH) (CA009110) إلى S.R.W. و J.H. تم تأييد هذا العمل
Materials
| 16% Paraformaldehyde Aqueous | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 15710 | |
| 10x PBS | Quality Biological | 119-069-161 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| BSA | Sigma | A1470 | |
| Horse Serum | Sigma | H-1270 | |
| 35mm x 10mm Petri Dish, Sterile, non-treated | CellTreat | P886-229638 | |
| Poly-L-lysine coated glass slides | Sigma | P0425-72EA | |
| Liquid Blocker Pen | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 71310 | |
| Humid Box | Evergreen | 240-9020-Z10 | |
| Wheaton Coplin Glass Staining Dish for 5 or 10 Slides | Fisher | 08-813E | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Microscope Cover Slides (22mmx60mm) | Fisher | 12-544-G | |
| Clear Nail Polish | Amazon | N/A | |
| Microsopes | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SteREO Discovery.V8 | Zeiss | 495015-0001-000 | |
| Observer Z1 | Zeiss | 4109431007994000 | |
| Zeiss ZEN 2012 blue edition image software | Zeiss | ||
| ORCA-Flash 4.0 CMOS camera | Hamamatsu | ||
| Primary Antibodies | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse anti-SYCP3 | Santa Cruz | sc-74569 | 1 in 50 |
| Rabbit anti-SYCP3 | Fisher (Novus) | NB300-231 | 1 in 1000 |
| Goat anti-SCP3 | Santa Cruz | sc-20845 | 1 in 50 |
| Human anti-Centromere Protein | Antibodies Incorporated | 15-235 | 1 in 100 |
| Mouse anti-alpha tubulin | Sigma | T9026 | 1 in 1000 |
| Mouse anti-AIM1 | BD Biosciences | 611082 | 1 in 200 |
| Mouse anti-γH2AX | Thermo Fisher | MA1-2022 | 1 in 500 |
| Mouse anti-CENT3 | Abnova | H00001070-M01 | 1 in 200 |
| Rabbit anti-pericentrin | Abcam | ab4448 | 1 in 200 |
| Rabbit anti-REC8 | Courtesy of Dr. Karen Schindler | N/A | 1 in 1000 |
References
- Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nature Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).
- Morelli, M. A., Cohen, P. E. Not all germ cells are created equal: Aspects of sexual dimorphism in mammalian meiosis. Reproduction. 130 (6), 761-781 (2005).
- Sun, F., Handel, M. A. Regulation of the meiotic prophase I to metaphase I transition in mouse spermatocytes. Chromosoma. 117 (5), 471-485 (2008).
- Namekawa, S. H. Slide preparation method to preserve three-dimensional chromatin architecture of testicular germ cells. J Vis Exp. (83), e50819 (2014).
- La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis. Methods Mol Biol. 558, 279-297 (2009).
- Galdon, G., Atala, A., Sadri-Ardekani, H. In vitro spermatogenesis: how far from clinical application?. Curr Urol Rep. 17 (7), (2016).
- Staub, C. A century of research on mammalian male germ cell meiotic differentiation in vitro. J Androl. 22 (6), 911-926 (2001).
- Page, J., Suja, J. A., Santos, J. L., Rufas, J. S. Squash procedure for protein immunolocalization in meiotic cells. Chromosome Res. 6 (8), 639-642 (1998).
- Kotaja, N., et al. Preparation, isolation and characterization of stage-specific spermatogenic cells for cellular and molecular analysis. Nat Methods. 1 (3), 249-254 (2004).
- Xu, X., Xu, P. A modified cryosection method for mouse testis tissue. Tissue Cell. 33 (2), 208-210 (2001).
- Hess, R., Moore, B. Histological methods for evaluation of the testis. Methods Toxicol. 3 (Pt A), 52-85 (1993).
- Bellvé, A. R. Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells. Methods Enzymol. 225, 84-113 (1993).
- Ventela, S., Toppari, J., Parvinen, M. Intercellular organelle traffic through cytoplasmic bridges in early spermatids of the rat: mechanisms of haploid gene product sharing. Mol Biol Cell. 14 (July), 2768-2780 (2003).
- Bellvé, A. R., et al. Dissociation of the mouse testis and characterization of isolated spermatogenic cells. J Histochem Cytochem. 25 (7), 480-494 (1977).
- Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. J Histochem Cytochem. 59 (1), 6-12 (2011).
- Zickler, D., Kleckner, N. Recombination, pairing, and synapsis of homologs during meiosis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (6), 1-26 (2015).
- Hunter, N. Meiotic recombination: the essence of heredity. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (12), 1-36 (2015).
- Scherthan, H., et al. Centromere and telomere movements during early meiotic prophase of mouse and man are associated with the onset of pairing. J Cell Biol. 134 (5), 1109-1125 (1996).
- Zickler, D., Kleckner, N. The leptotene-zygotene transition of meiosis. Annu Rev Genet. 32, 619-697 (1998).
- Scherthan, H. A bouquet makes ends meet. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (8), 621-627 (2001).
- Turner, J. Meiotic sex chromosome inactivation. Development. 134 (10), 1823-1831 (2007).
- Royo, H., et al. ATR acts stage specifically to regulate multiple aspects of mammalian meiotic silencing. Genes Dev. 27 (13), 1484-1494 (2013).
- Turner, J. M., et al. Silencing of unsynapsed meiotic chromosomes in the mouse. Nat Genet. 37 (1), 41-47 (2005).
- Marjanović, M., et al. CEP63 deficiency promotes p53-dependent microcephaly and reveals a role for the centrosome in meiotic recombination. Nat Commun. 6, 7676 (2016).
- Inanç, B., Dodson, H., Morrison, C. G. A Centrosome-autonomous signal that involves centriole disengagement permits centrosome duplication in G2 phase after DNA damage. Mol Biol Cell. 21, 3866-3877 (2010).
- Firat-Karalar, E. N., Sante, J., Elliott, S., Stearns, T. Proteomic analysis of mammalian sperm cells identifies new components of the centrosome. J Cell Sci. 127 (Pt 19), 4128-4133 (2014).
- Fukuda, N., et al. The transacting factor CBF-A/Hnrnpab binds to the A2RE/RTS element of protamine 2 mRNA and contributes to its translational regulation during mouse spermatogenesis. PLoS Genet. 9 (10), e1003858 (2013).
- Lahn, B. T., et al. Previously uncharacterized histone acetyltransferases implicated in mammalian spermatogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (13), 8707-8712 (2002).
- Mermoud, J. E., Tassin, A. M., Pehrson, J. R., Brockdorff, N. Centrosomal association of histone macroH2A1.2 in embryonic stem cells and somatic cells. Exp Cell Res. 268 (2), 245-251 (2001).
- Shanmugam, M., Hernandez, N. Mitotic functions for SNAP45, a subunit of the small nuclear RNA-activating protein complex SNAPc. J Biol Chem. 283 (21), 14845-14856 (2008).
- Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460 (7252), 278-282 (2009).
- Kotaja, N., et al. Preparation, isolation and characterization of stage-specific spermatogenic cells for cellular and molecular analysis. Nat Methods. 1 (3), 249-254 (2004).
- Amory, J. K., et al. Suppression of spermatogenesis by bisdichloroacetyldiamines is mediated by inhibition of testicular retinoic acid biosynthesis. J Androl. 32 (1), 111-119 (2011).
- Hogarth, C. A., et al. Turning a spermatogenic wave into a tsunami: synchronizing murine spermatogenesis using WIN 18,446. Biol Reprod. 88 (2), 40 (2013).
- Yoshida, S., et al. The first round of mouse spermatogenesis is a distinctive program that lacks the self-renewing spermatogonia stage. Development. 133 (8), 1495-1505 (2006).
- Kluin, P. M., Kramer, M. F., Rooij, D. G. Spermatogenesis in the immature mouse proceeds faster than in the adult. Int J Androl. 5 (3), 282-294 (1982).
- Rodriguez, I., Ody, C., Araki, K., Garcia, I., Vassalli, P. An early and massive wave of germinal cell apoptosis is required for the development of functional spermatogenesis. EMBO J. 16 (9), 2262-2270 (1997).
- Kangasniemi, M., et al. Modulation of basal and FSH dependent cyclic AMP production in rat seminiferous tubules staged by an improved transillumination technique. Anat Rec. 227 (1), 62-76 (1990).
- Martianov, I., et al. Late arrest of spermiogenesis and germ cell apoptosis in mice lacking the TBP-like TLF/TRF2 gene. Mol Cell. 7 (3), 509-515 (2001).
- Henriksén, K., Parvinen, M. Stage-specific apoptosis of male germ cells in the rat: Mechanisms of cell death studied by supravital squash preparations. Tissue Cell. 30 (6), 692-701 (1998).
