Viral kapsid yapısal bütünlük belirlenmesi için alternatif Vitro yöntemleri
Summary
Viral genom amplifikasyon kullanan rutin algılama yöntemleri bulaşıcı olmayan parçacıklar bulaşıcı ayırımcılık için kendi yetersizlik tarafından sınırlıdır. Bu makalenin amacı, aptamer bağlama, dinamik ışık saçılma ve transmisyon elektron mikroskobu kullanılarak bulaşıcı norovirus parçacıkların ayrımcılık yardım etmek alternatif yöntemler detaylı protokollerde sağlamaktır.
Abstract
İnsan norovirus önemli halk sağlığı ve ekonomik kayıplar dünya çapında önyargısı. Vitro ortaya çıkan ekimi gelişmeler henüz rutin virüs tespiti için geçerli değildir. Geçerli algılama ve öncelikle nükleik asit amplifikasyon güveniyor, miktar teknikleri bulaşıcı olmayan bulaşıcı viral saçılan ayırımcılık değil. Bu makalenin amacı birlikte daha da viral parçacıkların infektivite durumu hakkında bilgi almak için kullanılan teknikleri son gelişmeler üzerine belirli ayrıntıları sunmaktır. Bir tekniği norovirus ssDNA aptamer capsids için bağlama değerlendirme içerir. Aptamers kolayca sentezlenmiş ve avantajına sahip ve are ucuz ve istikrarlı. Başka bir tekniği, ışık saçılma (DL), dinamik kapsid davranış çözümde gözlemleyerek avantajına sahiptir. Elektron mikroskobu viral capsids yapısal bütünlüğünü görselleştirme için sağlar. Umut verici olsa da, bazı dezavantajları vardır her tekniği, non-spesifik aptamer bağlama olumlu tahsil moleküllere örnek matrisler, gelen arıtılmış kapsid DLS için gerekliliğini ve zavallı duyarlılık için elektron mikroskobu gibi için. Bu tekniklerin birlikte kullanıldığında, yine de, üretilen veri gövdesi daha kapsamlı bilgi infektivite, doğru değerlendirilmesi için gerekli olan bilgileri çıkarmak için kullanılan norovirus kapsid bütünlük sağlar inactivation yöntemleri veya virüs algılama yorumlanması. Bu makalede, bulaşıcı insan norovirus parçacıklar ayırımcılık için bu yöntemleri kullanarak iletişim kurallarını sağlar.
Introduction
İnsan norovirus sorumludur için önemli halk sağlığı yük genel olarak, 685 milyon hastalıklar ve 212,000 ölüm neden her yıl1, dolar2,3milyarlarca bir maliyetle. Bugün, norovirus algılama ve miktar genom amplifikasyon ve/veya ligand tabanlı platformlar içerir. Daha duyarlıdır, nicel bilgi sağlar ve yanlış pozitif sonuçlar4genellikle düşük riski vardır eski genellikle tercih edilir. En yaygın norovirus algılama ve miktar genom amplifikasyon tekniği transkriptaz nicel Polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) olduğunu. Çünkü bu hedefler ve insan norovirus genom küçük bir parçasını güçlendirir, RT-qPCR yalnız arasında ayrımcılık bulaşıcı yeteneğine sahip değildir ve bulaşıcı olmayan parçacıklar, ücretsiz genomik RNA genleri içeren capsids ve capsids ile ölümcül zarar genleri mutasyona uğramış/kesildi hala RT-qPCR tarafından çoğaltılabilir. İki yeni vitro yetiştirme teknikleri insan norovirus5,6 için son zamanlarda bildirilmiştir, her ikisi de hala RT-qPCR üzerinde virüs miktar için itimat ve henüz rutin klinik/çevre için uygun yöntemleri değildir insan noroviruses için test. Böylece, RT-qPCR klinik/çevre testleri için altın standart kalır.
Diğer vitro yöntemleri bir çaba daha iyi norovirus parçacıklar infektivite durumunu tahmin etmek için geliştirilmiştir. Bu yöntemler genellikle norovirus kapsid bütünlüğünü gidermek ve genom bütünlük değerlendirilmesi kategorize edilebilir. Eski yaklaşım daha popülerdir. Ancak bu ölümcül mutasyona viral parçacıkların yanı sıra sağlam kalır, ancak ana bilgisayar reseptörleri/co-faktörler bağlamak için yetenek eksikliği viral parçacıkların için hesaba katmaz RNase Önarıtma viral genomik RNA, çıkarma önce yaygın olarak kullanılan bir yöntem olduğunu veya kesilmiş ya da marjinal bozuk genleri7. Kapsid bütünlük de değerlendirildi virüs insan norovirus co-receptor/co-karbonhidrat olan faktörler, bağlama yeteneği dayalı histo-kan grubu antijenleri (HBGAs) da bilinir. HBGAs glikoproteinlerin veya glikolipitler (arasında birden çok diğer dokulara) parçası olarak ana bağırsak epitel hücrelerinde bulunan ve vücut sıvıları gibi salya salgıladığı. Enterik bakteri onların yüzeylerde HBGA benzeri maddeler içeren aynı zamanda insan norovirus8,9,10bağlamak için gösterilmiştir ve bu tür etkileşimler norovirus enfeksiyon5teşvik edebilir. HBGA bağlama kullanan temel kavramı sadece viral parçacıkların sözde reseptör/co-factor bağlama yetenekli hücreleri bulaşmasını yeteneğine sahip olacak olan. Birden fazla çalışmalar boncuk tabanlı HBGA bağlama nükleik asit amplifikasyon önceki infektivite ayrımcılık11,12,13,14için umut verici bir yöntem olduğunu göstermektedir, 15,16. HBGAs ile ilgili büyük bir sorun olduğunu hiçbir HBGA türü tüm insan norovirus genotip bağlayabilirsiniz. Bu sorunu çözmek için HBGAs içerir, domuz Gastrik müsin arıtılmış HBGA karbonhidrat sentezi, tutarlılık ve düşük maliyet kolaylığı çıkarına yerine kullanılmıştır.
Son yayın tarafından Moore vd. 17 insan norovirus kapsid bütünlük tahmin etmek için yeni teknikleri bir dizi tanıttı. HBGAs yerine, Moore vd. 17 geniş reaktif nükleik asit aptamer (M6-2)18 ve geniş reaktif Monoklonal antikor (NS14)19 ısıl GII.4 Sydney norovirus capsids (virüs gibi parçacıkların veya VIP) için bağlama incelenmiş ve bu karşılaştırıldığında sentetik HBGAs için bağlanma. Nükleik asit aptamers kısa (~ 20-80 nt) tek telli nükleik sırasına bir sonucu olarak benzersiz üç boyutlu yapılar içine kat ve bir hedef bağlamak asitler (ssDNA veya RNA) vardır. Nükleik asitler olduklarından daha az masraflı olduklarını; kolayca kimyasal sentez, saflaştırılmış ve değiştirilmiş; ve ısı için kararlı. Aptamers noroviruses karşı oluşturulan çeşitli raporlar var, bazıları ile suşları18,20,21,22çeşitli geniş reaktivite gösterilen. Örnek yoluyla, Moore vd. 17 o aptamer M6-2 arıtılmış, birleştirilmiş insan norovirus capsids (VIP) bağlanmış ve benzer şekilde yüksek sipariş (Örneğin, ikincil ve üçüncül) protein yapısı için korumak için viral kapsid üzerine güven içinde HBGA için davrandım gösterdi gerçekleşmesi için bağlayıcı. Öte yandan, capsids tamamen denatüre sonra norovirus VIP bağlama antikor için önemli bir bölümünü NS14 kaldı. Moore ve ark. çalışmayla bağlamasında norovirus değerlendirilmesi 17 yapıldı aptamers antikorlar yerine kullanılır istisna ile ELISA için benzer bir basit, plaka tabanlı yöntemi kullanarak (dolayısıyla yöntem ELASA çağrıldı). Bu yüksek işlem hacmi deneysel yöntem farklı tedaviler norovirus kapsid, fiziksel veya kimyasal stres maruz üzerine viral inactivation mekanizmasının anlamak için değerli iş üzerinde etkilerini değerlendirmek için kullanıldı. Ancak, bu yöntemin bir dezavantajı düşük duyarlılık ve matris ilişkili kirletici non-spesifik bağlama tarafından aptamers neden yüksek düzeyde için hoşgörü eksikliği var.
Moore vd. 17 başka bir yöntem, dinamik ışık (DL), saçılma toplama ısıl işlem yanıt olarak viral parçacıkların izlemek için kullanılır. DLS nanopartikül süspansiyonlar boyutunu değerlendirmek için yaygın olarak kullanılır ve proteinler23,24 ve virüsleri25,26,27için genişletilmiş. Çözüm parçacıklar tarafından dağınık ışığın şiddetini partikül büyüklüğü, difüzyon katsayısı ve köklü formülleri kullanarak parçacık çapı hesaplanması için izin veren bir fonksiyonu olarak değişiklik gösterir. DLS tekniği dağınık virüsler, bireysel kapsid protein veya dimer ve virüs toplam boyutu27tarihinde dayalı olarak algılanmasını sağlar Nano aşağı dağınık parçacıkların hidrodinamik çapı ayırt edebilirsiniz. Virüs toplama, parçacık boyutu, bir artış gösterdiği kapsid bütünlüğü kaybı göstergesidir. Kapsid denatüre ve yapısını bozdu, hidrofobik kalıntıları maruz olur ve parçacıklar birlikte hareket ve toplamları oluşturmak neden. DLS den sonra belirtilen bir tedavi ya da gerçek zamanlı17,28toplamada Kinetik partikül büyüklüğü ölçmek için kullanılabilir. Bu yöntem gözlem kapsid davranışının çözümde izin avantajı vardır ama hangi-ebilmek değil var olmak tamamen doğal haliyle virüs temsilcisi arıtılmış kapsid, yüksek konsantrasyonda gerektirir.
Moore ve ark. tarafından kullanılan son yöntem 17 transmisyon elektron mikroskobu (TEM) yapıldı. Her ne kadar bu yöntemi duyarlılık yoksun ve nicel veri üretmek değildir viral kapsid yapısı üzerinde farklı tedavilerin etkileri görselleştirme için sağlar. Henüz ideal değil her ne kadar klinik/çevre ayarları için bu yöntemleri birlikte insan norovirus inactivation anlamakta değerlidir. Bu makalenin amacı, plaka tabanlı bağlama tahlil için (ELASA), DL, derinlemesine protokolleri sağlamaktır ve TEM hazırlama yöntemleri için kullanılan tedaviler etkileri kapsid bağlamında norovirus kapsid ısı tedavi etkilerini araştırmak Moore ve ark. içinde sunulan bütünlüğü 17.
Protocol
Representative Results
Discussion
İletişim kuralı ve burada açıklanan teknikleri insan norovirus kapsid bütünlüğü/işlevleri değerlendirmek için bir yol sağlar. Bu yöntemler mekanik kavrama içine belgili tanımlık virüs karşı inactivation tedavi etkileri elde etmek için kullanılabilir ve potansiyel olarak daha geleneksel inactivation değerlendirme yöntemleri gibi RT-qPCR veya plak tahlil destekleyebilirsiniz. Örneğin, kimyasal veya fiziksel inactivation plak tahlil yalnız tarafından değerlendirilmesi virüs inactivation derece…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser NoroCORE proje ile tarım ve gıda araştırma girişimi rekabetçi Grant No 2011-68003-30395 ABD Tarım Bakanlığı, Ulusal Enstitüsü gıda ve tarım tarafından desteklenmiştir. Açık erişim ücret karşılığında fon ABD Tarım Bakanlığı tarafından sağlandı. Robert Atmar (Baylor College of Medicine, Houston, TX) lütfen bizi saf capsids ve Valerie Lapham TEM görüntülerle yardımını sağlamak için teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca Frank N. Barry bize sunulan deneyler başlatmak yardımcı olduğunuz için teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Plate-Based Binding Assay for Evaluating Loss of Higher Order Norovirus Capsid Structure | |||
| 96-well, medium-binding polystyrene EIA plate | Fisher (Costar) | 07-200-36 | |
| Lid for 96-well plate | Thermo Fisher | 3098 | |
| Paraffin film (Parafilm) | Thermo Fisher | PM999 | |
| 1x PBS (pH 7.2) | Life Technologies | 20012-050 | |
| Polysorbate 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| 1x PBS (pH 7.2) + 0.05% Polysorbate 20 | N/A | N/A | |
| Purified, assembled human norovirus GII.4 capsids | N/A | N/A | |
| Individual 0.2 ml PCR tubes | Genesee Scientific | 22-154G | |
| 2 thermocyclers | Bio-Rad | 1861096 | |
| Tabletop mini centrifuge | Fisher Scientific | 12-006-901 | |
| Skim milk solids | Thermo Fisher | LP0031B | |
| Synthetic histo-blood group type A disaccharide, biotinylated | Glycotech | 01-017 | |
| Biotinylated aptamer M6-2 (stock concentration 100 µM in nuclease-free water): 5'-/5Biosg/AGTATACGTATTACCTGCAGCTGGGAAGAGGTCCGGTAAATGCAGGGTCAGCCCGGAGAGCGATATCTCGGAGATCTTGC -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Streptavidin-horseradish peroxidase conjugate (ELISA grade), We use Life Technologies SNN2004 | Life Technologies | SNN2004 | |
| 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) substrate, room temperature | Thermo Fisher | 50-76-00 | |
| 1 M phosphoric acid | N/A | N/A | |
| Microplate reader capable of reading 450 nm | Tecan | Infinite m200 Pro | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analysis of Plate-Based Assay Results | |||
| Microsoft Excel or similar program | N/A | N/A | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dynamic Light Scattering Experiments | |||
| Zetasizer ZSP, or similar particle size analysis instrument | Malvern Instruments | N/A | |
| Vortex | Fisher Scientifc | 02-215-365 | |
| Quartz cuvette | Hellma | 104-002-10-40 | |
| Small volume disposable cuvette (to reduce VLP use) | Malvern Instruments | ZEN0040 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transmission Electron Microscopy Sample Preparation | |||
| Nickel electron microscopy grids with carbon support film | Ladd Research | 10880-100 | |
| Self-closing reverse electron microscopy tweezers | Ted Pella | 5372-NM | |
| Qualitative filter paper | Sigma-Aldrich (Whatman) | WHA1002055 | |
| Glass petri dishes | Sigma-Aldrich | BR455743 | |
| 100 mM stock HEPES solution (pH 7.2) | N/A | N/A | |
| 2% uranyl acetate | N/A | N/A |
References
- Kirk, M. D., et al. World Health Organization estimates of the global and regional disease burden of 11 foodborne bacterial, protozoal, and viral diseases, 2010: A data synthesis. PLOS Med. 12 (12), e1001920 (2015).
- Scharff, R. L. Economic burden from health losses due to foodborne illness in the United States. J. Food Prot. 75 (1), 123-131 (2012).
- Lee, B. Y., Mcglone, S. M., Bailey, R. R., Zachary, S., Umscheid, C. A., Muder, R. R. Economic impact of outbreaks of norovirus infection in hospitals. Infect. Control Hosp. Epidemiol. 32 (2), 191-193 (2011).
- Law, J. W. -. F., Ab Mutalib, N. -. S., Chan, K. -. G., Lee, L. -. H. Rapid methods for the detection of foodborne bacterial pathogens: principles, applications, advantages and limitations. Front. Microbiol. 5, 770 (2015).
- Jones, M. K., et al. Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells. Science. 346 (6210), 755-759 (2014).
- Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell – derived human enteroids. Science. 5211, (2016).
- Moore, M. D., Goulter, R. M., Jaykus, L. -. A. Human norovirus as a foodborne pathogen: challenges and developments. Annu. Rev. Food Sci. Technol. 6 (1), 411-433 (2015).
- Miura, T., et al. Histo-blood group antigen-like substances of human enteric bacteria as specific adsorbents for human noroviruses. J. Virol. 87 (17), 9441-9451 (2013).
- Almand, E. A., et al. Human norovirus binding to select bacteria representative of the human gut microbiota. Plos One. 12 (3), e0173124 (2017).
- Rubio-del-Campo, A., et al. Noroviral P-Particles as an in vitro model to assess the interactions of noroviruses with probiotics. PLoS ONE. 9 (2), e89586 (2014).
- Hirneisen, K. A., Kniel, K. E. Comparison of ELISA attachment and infectivity assays for murine norovirus. J. Virol. Methods. 186 (1-2), 14-20 (2012).
- Dancho, B. A., Chen, H., Kingsley, D. H. Discrimination between infectious and non-infectious human norovirus using porcine gastric mucin. Int. J. Food Microbiol. 155 (3), 222-226 (2012).
- Li, X., Chen, H. Evaluation of the porcine gastric mucin binding assay for high-pressure-inactivation studies using murine norovirus and Tulane virus. Appl. Environ. Microbiol. 81 (2), 515-521 (2015).
- Lou, F., et al. High-pressure inactivation of human norovirus virus-like particles provides evidence that the capsid of human norovirus is highly pressure resistant. Appl. Environ. Microbiol. 78 (15), 5320-5327 (2012).
- Wang, D., Tian, P. Inactivation conditions for human norovirus measured by an in situ capture-qRT-PCR method. Int. J. Food Microbiol. 172, 76-82 (2014).
- Wang, D., Xu, S., Yang, D., Young, G. M., Tian, P. New in situ capture quantitative (real-time) reverse transcription-PCR method as an alternative approach for determining inactivation of Tulane virus. Appl. Environ. Microbiol. 80 (7), 2120-2124 (2014).
- Moore, M. D., Bobay, B. G., Mertens, B., Jaykus, L. Human norovirus aptamer exhibits high degree of target conformation-dependent binding similar to that of receptors and discriminates particle functionality. mSphere. 1 (6), e00298-e00216 (2016).
- Moore, M. D., Escudero-Abarca, B. I., Suh, S. H., Jaykus, L. -. A. Generation and characterization of nucleic acid aptamers targeting the capsid P domain of a human norovirus GII.4 strain. J. Biotechnol. 209, 41-49 (2015).
- Kitamoto, N., et al. Cross-Reactivity among Several Recombinant Calicivirus Virus-Like Particles (VLPs) with Monoclonal Antibodies Obtained from Mice Immunized Orally with One Type of VLP. J. Clin. Microbiol. 40 (7), 2459-2465 (2002).
- Giamberardino, A., et al. Ultrasensitive norovirus detection using DNA aptasensor technology. PloS one. 8 (11), e79087 (2013).
- Beier, R., et al. Selection of a DNA aptamer against norovirus capsid protein VP1. FEMS Microbiol. Lett. 351 (2), 162-169 (2014).
- Escudero-Abarca, B. I., Suh, S. H., Moore, M. D., Dwivedi, H. P., Jaykus, L. -. A. Selection, characterization and application of nucleic acid aptamers for the capture and detection of human norovirus strains. PloS one. 9 (9), e106805 (2014).
- Bhattacharjee, S. DLS and zeta potential – What they are and what they are not?. Journal Control. Release. 235, 337-351 (2016).
- Khodabandehloo, A., Chen, D. D. Y. Particle sizing methods for the detection of protein aggregates in biopharmaceuticals. Bioanalysis. 9 (3), 313-326 (2017).
- Mattle, M. J., et al. Impact of virus aggregation on inactivation by peracetic acid and implications for other disinfectants. Environ. Sci. Technol. 45, 7710-7717 (2011).
- Samandoulgou, I., Fliss, I., Jean, J. Zeta potential and aggregation of virus-like particle of human norovirus and feline calicivirus under different physicochemical conditions. Food Environ. Virol. 7 (3), 249-260 (2015).
- Mertens, B. S., Velev, O. D. Soft matter norovirus interactions. Soft Matter. 11, 8621-8631 (2015).
- Panyukov, Y., Yudin, I., Drachev, V., Dobrov, E., Kurganov, B. The study of amorphous aggregation of tobacco mosaic virus coat protein by dynamic light scattering. Biophys. Chem. 127 (1-2), 9-18 (2007).
- Moore, M. D., Escudero-Abarca, B. I., Jaykus, L. -. A. An Enzyme-Linked Aptamer Sorbent Assay to Evaluate Aptamer Binding. Methods in Molecular Biology. 1575, 291-302 (2017).
- Langlet, J., Gaboriaud, F., Gantzer, C. Effects of pH on plaque forming unit counts and aggregation of MS2 bacteriophage. J. Appl. Microbiol. 103, 1632-1638 (2007).
- Manuel, C. S., Moore, M. D., Jaykus, L. A. Destruction of the Capsid and Genome of GII.4 Human Norovirus Occurs during Exposure to Metal Alloys Containing Copper. Appl. Environ. Microbiol. 81 (15), 4940-4946 (2015).
- Warnes, S. L., Summersgill, E. N., Keevil, C. W. Inactivation of murine norovirus on a range of copper alloy surfaces is accompanied by loss of capsid integrity. Appl. Environ. Microbiol. , (2014).
- Manuel, C., Moore, M. D., Jaykus, L. -. A. Efficacy of a disinfectant containing silver dihydrogen citrate against GI.6 and GII.4 human norovirus. J. Appl. Microbiol. 122 (1), 78-86 (2017).
- Green, N. M. Avidin and streptavidin. Methods Enzymol. 184, 51-67 (1990).
- Kingsley, D. H., Vincent, E. M., Meade, G. K., Watson, C. L., Fan, X. Inactivation of human norovirus using chemical sanitizers. Int. J. Food Microbiol. 171, 94-99 (2014).
- Tian, P., Yang, D., Quigley, C., Chou, M., Jiang, X. Inactivation of the Tulane virus, a novel surrogate for the human norovirus. J. Food Prot. 76 (4), 712-718 (2013).
- Li, D., Baert, L., Van Coillie, E., Uyttendaele, M. Critical studies on binding-based RT-PCR detection of infectious noroviruses. J. Virol. Methods. 177 (2), 153-159 (2011).
