Альтернативные в Vitro методы для определения вирусного капсида структурной целостности

Человека норовирус отвечает за бремя значительного общественного здравоохранения во всем мире, вызывая около 685 миллионов заболеваний и 212 000 смертей ежегодно¹, стоимостью в миллиарды долларов^2,3. Сегодня норовирус обнаружения и количественного определения включает амплификацию генома и/или лиганд-платформ. Первый обычно предпочтительным, как он является более чувствительным, обеспечивает количественную информацию и имеет обычно более низкий риск⁴ложных положительных результатов. Наиболее распространенными норовирус обнаружения и количественного определения генома усиления техники является обратной транскриптазы количественных полимеразной цепной реакции (RT-ПЦР). Потому что она направлена и усиливает небольшой сегмент генома человека норовирус, RT-ПЦР в одиночку не способны проводить дискриминацию между инфекционных и неинфекционных частицы, как свободный геномной РНК, повреждения capsids, содержащие геномов и capsids с смертельно мутировал/усечен геномов могут по-прежнему усиливается RT-ПЦР. Хотя недавно поступили два новых в vitro культивирования методов для человека норовирус^5,6 , оба по-прежнему полагаются на RT-ПЦР для количественного определения вирусов и еще не являются возможные методы для рутинных клинических и экологические тестирование для человека норовирусы. Таким образом RT-ПЦР остается золотым стандартом для клинических/окружающей среды тестирования.

В попытке лучше оценить состояние инфективности норовирус частиц были разработаны другие методы в пробирке . Эти методы могут быть вообще отнесены те, которые касаются целостность норовирус капсида и те оценки целостности генома. Первый подход является более популярным. Часто используемым методом является РНКазы предварительной обработки до извлечения вирусного геномной РНК, однако это не учитывает вирусные частицы, которые остаются нетронутыми, но не имеют возможности привязки узла рецепторов/co факторов, а также вирусные частицы, которые мутировали смертельно или обрезать или незначительно повреждены геномов⁷. Капсид целостность может также оцениваться основано на способности вируса для привязки к человека норовирус co-receptor/co факторов, которые являются углеводы известен как группа крови histo антигены (HBGAs). HBGAs присутствуют в кишечной эпителиальных клеток хозяина в составе гликопротеинов или гликолипидов (среди нескольких других тканях) и может быть сделано секретным в телесных жидкостей, таких как слюна. Также было показано кишечные бактерии, содержащие HBGA-подобных веществ на их поверхности, привязать человека норовирус^8,9,10, и такого взаимодействия может способствовать норовирус инфекции⁵. Основная концепция использования HBGA привязки является, что только вирусные частицы способны привязки предполагаемого рецептор/co-factor будет способен заражать клетки. Множественные исследования показывают, что шарик-привязку на основе HBGA предшествующего амплификация нуклеиновой кислоты является перспективным методом инфективности дискриминации^{11,12,13,14, 15,16}. Одной из основных задач относительно HBGAs является, что без одного HBGA типа можно привязать все человеческие норовирус генотипов. Для решения этой проблемы, свиного желудка муцина, который содержит HBGAs, был использован вместо очищенный HBGA углеводы в интересах простоты синтеза, последовательность и снижение стоимости.

В недавно опубликованном Мур и др. ¹⁷ представил набор новых методов для оценки целостности человека норовирус капсида. Вместо HBGAs, Мур и др. ¹⁷ расследование привязки широко реактивной нуклеиновой кислоты aptamer (M6-2)¹⁸ и¹⁹ широко реактивной моноклональных антител (NS14) – термически capsids GII.4 Сидней норовирус (вирус типа частиц или VLP) и сравнил это для привязки к синтетическим HBGAs. Нуклеиновые кислоты аптамеры являются короткие (~ 20-80 nt) одного мель нуклеиновые кислоты (ssDNA или РНК), сложить в уникальных трехмерных структур вследствие их последовательности и связывающие цели. Потому что они нуклеиновых кислот, они являются менее дорогостоящими; легко химически синтезированных, очищенная и изменение; и стабильной для тепла. Существует несколько сообщений о аптамеры генерируется против норовирусов, с некоторыми из них показаны широкий реактивности в различных штаммов^18,20,21,22. В качестве примера, Мур и др. ¹⁷ показали что aptamer M6-2 привязан к capsids очищенный, собранных человека норовирус (VLP) и аналогичным образом относились к HBGA в зависимость от вирусного капсида поддерживать высшего порядка (например, среднее и высшее) структуры белков для Привязка к произойти. С другой стороны значительная доля норовирус VLP Связывание антитела к NS14 остались после того, как были полностью денатурированный capsids. Оценка норовирус привязки в исследовании Мур и др. ¹⁷ было сделано с помощью простой, основанного на пластину метода аналогичны ELISA, за исключением, что вместо антитела используются аптамеры (отсюда был вызван метод ELASA). Этот экспериментальный метод высокой пропускной способности использовался для оценки влияния различных методов лечения на норовирус капсида, работу, которая является ценной для понимания механизма вирусной инактивации после воздействия на физические или химические раздражители. Однако один из недостатков этого метода является нижней чувствительность и отсутствие терпимости для матрицы связанные загрязняющих веществ на более высоких уровнях, которые вызывают неспецифической привязки путем аптамеры.

Мур и др. ¹⁷ используется другой метод, динамического рассеяния света (DLS), для мониторинга агрегации вирусных частиц в ответ термической обработки. DLS часто используется для оценки размера наночастиц суспензий и был продлен до^23,белки вирусов и^{24 26,}–^25,27. Интенсивность света, рассеянного частиц в растворе колеблется в зависимости от размера частиц, позволяя для расчета коэффициента диффузии и затем диаметр частиц, устоявшихся формулам. DLS технику можно отличить гидродинамические диаметр дисперсных частиц вплоть до наноразмерных, который позволяет обнаружения рассредоточенных вирусов, отдельных капсульных белков или димеры и вирус статистическими выражениями, основанными на размер²⁷. Вирус агрегации, представленный увеличение размера частиц, свидетельствует о потери целостности капсида. Как денатурировано капсида и нарушается его структуры, гидрофобные остатки подвергаются и вызывают частицы слипаются и образуют агрегаты. DLS может использоваться для измерения размера частиц после указанного обращения или кинетика агрегации в реальном времени^17,28. Этот метод имеет преимущество, позволяя наблюдения поведения капсида в растворе, но требует высокой концентрации очищенный капсида, которые не могут быть полностью представительным вируса в своем естественном состоянии.

Последний метод, используемые Мур и др. ¹⁷ был просвечивающей электронной микроскопии (ТЕА). Хотя этот метод не хватает чувствительности и не производят количественных данных, он позволяет для визуализации эффектов различных обработок вирусного капсида структуры. Хотя не еще идеально подходит для клинических и экологические параметры, использование этих методов в сочетании ценные в понимании человека норовирус инактивации. Цель этой статьи — предоставить углубленные протоколы для привязки на основе плиты assay (ELASA), DLS, и методы подготовки ТЕА используется для исследовать влияние термообработки на норовирус капсида в контексте лечения последствий капсид целостность, представленные в Moore et al. ¹⁷.