שיטות אלטרנטיביות במבחנה מצפני Capsid ויראלי המבנית

Norovirus האנושי הוא אחראי על נטל ניכר בבריאות הציבור ברחבי העולם, גורם על 685 מיליון מחלות ותמותה 212,000 מדי שנה¹, בעלות של מיליארדים של דולרים^2,3. היום, norovirus זיהוי, כימות כרוך הגנום הגברה ו/או פלטפורמות מבוססות-ליגנד. הראשון הוא בדרך כלל עדיף כפי שהוא רגיש יותר, מספק מידע כמותי, יש סיכון נמוך יותר באופן כללי של תוצאות חיוביות שגויות⁴. הנפוץ ביותר norovirus זיהוי, כימות הגנום הגברה הטכניקה היא תגובת שרשרת של פולימראז כמותיים רוורס טרנסקריפטאז (RT-qPCR). כי היא מטרות, מגביר את מקטע קטן של הגנום האנושי norovirus, RT-qPCR לבד אינה מסוגלת האפליה בין זיהומיות ופגעו חלקיקים שאינן זיהומיות, כמו ה-RNA הגנומי חינם, capsids המכיל הגנום, capsids עם אנושות מוטציה/קטום הגנום יכול עדיין להיות מוגבר על ידי RT-qPCR. בעוד שני במבחנה הטיפוח-תרגול טכניקות חדשות norovirus אנושי^5,6 דווחו לאחרונה, שניהם עדיין לסמוך על RT-qPCR על וירוס כימות, עדיין לא ריאלי שיטות שגרתיות קליני/סביבתיים בדיקת noroviruses האנושית. לפיכך, RT-qPCR נשאר תקן הזהב בדיקה קלינית/סביבתיים.

שיטות אחרות במבחנה פותחו במטרה להעריך טוב יותר את המצב infectivity של חלקיקים norovirus. שיטות אלה יכולים להיות מסווגים בדרך כלל כ אלה המטפלות שלמות capsid norovirus ואלה הערכת תקינות הגנום. הגישה פופולרי יותר. השיטה הנפוצה היא RNase רעלני לפני מיצוי של נגיפי RNA הגנומי, אולם זה אינו חשבון נגיפים נשארים בעינם, אך חוסר היכולת לאגד מארח קולטנים/co-גורמים, כמו גם חלקיקים נגיפיים כי יש מוטציה אנושות או יש נחתך או שולית פגום הגנום⁷. שלמות capsid גם ניתן להעריך בהתבסס על היכולת של הווירוס כדי לאגד norovirus האנושי co-receptor/co-גורמים, אשר הם פחמימות המכונה אנטיגנים קבוצה היסטו-דם (HBGAs). HBGAs נמצאים בתאי האפיתל במעי מארח כחלק glycoproteins או glycolipids (בין מספר רקמות אחרות), עשוי להיות מופרש בנוזלי גוף שונים כמו רוק. בה חיידק המכילים חומרים דמויי-HBGA על משטחים שלהם יש גם הוכח כדי לאגד norovirus האנושי^8,9,10, אינטראקציות כאלה עשויים לקדם norovirus זיהום⁵. התפיסה הבסיסית של ניצול HBGA מחייב הוא כי רק מסוגל מחייב את בשם הקולטן/co-factor נגיפים יהיה מסוגל להדביק תאים. מחקרים רבים מראים כי מבוסס-חרוז איגוד HBGA שקדמו חומצת גרעין הגברה היא שיטה מבטיחה infectivity אפליה^{11,12,13,14, 15,16}. האתגר העיקרי לגבי HBGAs היא כי אין סוג HBGA יחיד באפשרותך לאגוד כל norovirus אנושיים אחרים. כדי לטפל בבעיה זו, שימש חזירי mucin קיבה, אשר מכיל HBGAs, במקום פחמימות מטוהרים HBGA כדי לשמור על נוחות של סינתזה, עקביות, עלות מופחתת.

פרסום זה התבצעה על ידי מור. et al. ¹⁷ הציג סט של טכניקות חדשות עבור הערכת תקינות capsid norovirus אנושי. במקום HBGAs, מור. et al. ¹⁷ חקרו את הכריכה של חומצת גרעין בהרחבה תגובתי aptamer (M6-2)¹⁸ ו ש GII.4 סידני שילדת norovirus capsids (חלקיקים דמויי וירוס או האח מים)¹⁹ בהרחבה תגובתי נוגדנים חד שבטיים (NS14), לעומת זאת על הכריכה כדי HBGAs סינתטי. חומצת גרעין aptamers הם קצר (~ 20-80 nt) יחיד נטושים חומצות גרעין (ssDNA או RNA) לקפל לתוך מבנים תלת מימדיים ייחודיים כתוצאה הרצף שלהם, לאגד מטרה. כי הם חומצות גרעין, הם פחות יקר; בקלות כימית מסונתז מטוהרים, שונה; יציב לחום קיימים מספר דיווחים של aptamers שנוצר נגד noroviruses, עם חלק מהם מציג תגובתיות רחב מגוון של זנים^18,20,21,22. דוגמה, מור. et al. ¹⁷ הפגינו את aptamer M6-2 קשורה norovirus האנושי מטוהרים, שהורכב capsids (האח מים) ו התנהגה באופן דומה כדי HBGA והתלות capsid ויראלי כדי לשמור על מבנה החלבון סדר (למשל, משניות ושלישוניות) גבוה יותר עבור כריכת להתרחש. מצד שני, חלק ניכר norovirus האח מים מחייב נוגדן NS14 נותרה לאחר היו capsids שפגע בסימני לחלוטין. הערכה של איגוד norovirus במחקר על ידי מור. et al. ¹⁷ נעשתה באמצעות שיטה פשוטה, המבוססים על צלחת דומה, אליסה, למעט כי aptamers משמשים במקום נוגדנים (ומכאן השיטה נקראה ELASA). זו השיטה הניסיונית של תפוקה גבוהה שימש כדי להעריך את ההשפעות של טיפולים שונים על capsid norovirus, עבודה זה חשוב להבנת המנגנון של איון ויראלי בתגובה לחשיפה לחצים פיזי או כימי. עם זאת, חסרון אחד לשיטה זו הוא נמוך יותר רגישות חוסר סובלנות כלפי מזהמים מטריקס-הקשורים ברמות גבוהות יותר, הגורמות מחייב שאינם ספציפיים על-ידי aptamers.

מור. et al. ¹⁷ להשתמש בשיטה אחרת, אור דינאמי פיזור (DLS), כדי לפקח על צבירה של נגיפים בתגובה טיפול בחום. DLS משמש בדרך כלל כדי להעריך את הגודל של ננו-חלקיק המתלים, הורחבה חלבונים^23,24 ווירוסים^25,26,27. עוצמת האור מפוזר על ידי חלקיקים בתמיסה תנודות כפונקציה של גודל החלקיקים, המאפשר חישוב מקדם דיפוזיה ולאחר מכן קוטר חלקיקים באמצעות נוסחות ומבוססת. הטכניקה DLS יכולים להבחין הקוטר hydrodynamic של חלקיקים התפזרו עד הננומטרי, המאפשר זיהוי של וירוסים התפזרו, חלבונים capsid בודדים או הדימרים אגרגטים וירוס מבוסס על גודל²⁷. מצבור וירוס, המיוצג על-ידי עלייה גודל החלקיקים, הוא מרמז על אובדן של capsid שלמות. Capsid הוא שפגע בסימני, המבנה שלו משובשות, שאריות הידרופובי הופכים חשופים וגורמים החלקיקים להישאר ביחד ויוצרים אגרגטים. DLS יכול לשמש כדי למדוד את גודל החלקיקים לאחר טיפול שצוין או את קינטיקה של מצבור בזמן אמת^17,28. בשיטה זו יש את היתרון של ומאפשר תצפית בהתנהגות capsid בפתרון אך דורש ריכוז גבוה של capsid מטוהרים, אשר ייתכן שאינו לגמרי נציג של הוירוס במצבו הטבעי.

השיטה האחרונה מנוצל על ידי מור. et al. ¹⁷ היה במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM). למרות ששיטה זו חסר רגישות, אינו מייצר נתונים כמותיים, היא מאפשרת הדמיה של ההשפעות של טיפולים שונים על המבנה capsid ויראלי. למרות שלא עדיין אידיאלי עבור הגדרות קליני/סביבתיים, השימוש בשיטות אלה בשילוב הוא חשוב בהבנת האדם norovirus איון. מטרת מאמר זה היא לספק פרוטוקולים מעמיק המבוסס על צלחת איגוד וזמינותו (ELASA), DLS, והשתמשו בשיטות הכנה TEM כדי לחקור את ההשפעות של טיפולים תרמיים על capsid norovirus בהקשר של ההשפעות של הטיפולים על capsid שלמות כפי שהוצג במור. et al. ¹⁷.