أساليب بديلة في المختبر لتحديد السلامة الهيكلية قفيصه الفيروسية

نوروفيروس البشرية المسؤولة عن عبئا كبيرا في مجال صحة العامة على الصعيد العالمي، تسبب الأمراض حوالي 685 مليون و 212,000 حالة وفاة سنوياً¹، بتكلفة تقدر بمليارات الدولارات^2،3في. واليوم، نوروفيروس الكشف والتحديد الكمي ينطوي التضخيم الجينوم و/أو الأنظمة الأساسية المستندة إلى يجند. الأول المفضل عموما كما أكثر حساسية، ويوفر المعلومات الكمية، وقد خطر أقل عموما من النتائج الإيجابية الكاذبة⁴. الأكثر شيوعاً نوروفيروس الكشف والتحديد الكمي الجينوم التضخيم هو التقنية المنتسخة العكسية الكمية تفاعل البوليميراز المتسلسل (RT-قبكر). لأنه يستهدف ويسهب شريحة صغيرة من الجينوم البشري نوروفيروس، الرايت-qPCR وحدها ليست قادرة على التمييز بين المعدية والجسيمات غير المعدية، كالجيش الملكي النيبالي الجينوم مجاناً، تضررت كابسيدس التي تحتوي على الجينوم، وكابسيدس مع قاتلة يمكن أن لا تزال تضخيم جينومات المتحولة باقتطاع من الرايت qPCR. بينما سجلت مؤخرا اثنين في المختبر زراعة تقنيات جديدة للبشرية نوروفيروس^5،6 ، على حد سواء لا تزال تعتمد على الرايت qPCR للفيروس الكمي وليست أساليب مجدية الروتينية السريرية والبيئة اختبار للبشرية نوروفيروسيس. وهكذا، يبقى RT qPCR المعيار الذهبي للتجارب السريرية والبيئة.

وقد وضعت أساليب أخرى في المختبر في محاولة لتقدير أفضل حالة العدوى من جسيمات نوروفيروس. ويمكن تصنيف هذه الأساليب عموما كتلك التي تتناول سلامة قفيصه نوروفيروس، والقائمين بتقييم سلامة الجينوم. النهج السابق أكثر شعبية. هو أسلوب استخداماً رناسي المعالجة المسبقة قبل استخراج الحمض النووي الريبي الجينوم الفيروسي، ولكن هذا لا يفسر الجسيمات الفيروسية، لا تزال سليمة ولكنها تفتقر إلى القدرة على ربط المضيف مستقبلات/co-العوامل، فضلا عن الجسيمات الفيروسية أن تحور قاتلة أو اقتطاع أو تلف هامشيا الجينوم⁷. سلامة قفيصه يمكن أيضا تقييم يستند إلى قدرة الفيروس على ربط نوروفيروس البشرية المشارك-ريسيبتور/co-العوامل التي هي الكربوهيدرات المعروفة باسم histo-الدم مجموعة مولدات المضادات (هبجاس). هبجاس موجودة في الخلايا الظهارية المعوية المضيف كجزء من جليكوبروتينس أو جليكوليبيدس (بين متعددة الأنسجة الأخرى) وقد يفرز في سوائل الجسم مثل اللعاب. قد أظهرت أيضا البكتيريا المعوية التي تحتوي على مواد مثل هبجا على الأسطح لربط نوروفيروس البشرية^8،،من⁹¹⁰، وقد تشجع مثل هذه التفاعلات نوروفيروس العدوى⁵. أن المفهوم الأساسي لاستخدام الربط هبجا أن قادرة على ملزمة المفترضة المستقبلات/المشارك-فكتور الفيروسية الجسيمات فقط ستكون قادرة على إصابة الخلايا. دراسات متعددة تشير إلى أن أساس حبة هبجا الملزمة السابقة لتضخيم الحمض النووي وسيلة واعدة للعدوى التمييز^11،،من^{1213،14، ،}من ¹⁵¹⁶. تحديا كبيرا فيما يتعلق هبجاس أن لا واحد من نوع هبجا يمكنك ربط جميع الأنماط الجينية البشرية نوروفيروس. لمعالجة هذا الوضع، قد استخدمت الميوسين المعدة الخنزير، الذي يحتوي على هبجاس، بدلاً من الكربوهيدرات هبجا المنقي حرصا على سهولة التوليف والاتساق، وخفض التكلفة.

منشور صدر مؤخرا من مور et al. ¹⁷ عرض مجموعة من التقنيات الجديدة لتقدير سلامة قفيصه نوروفيروس البشرية. بدلاً من هبجاس، مور et al. ¹⁷ التحقيق ملزم رد الفعل على نطاق واسع من الحمض النووي ابتمر (M6-2)¹⁸ و رد الفعل على نطاق واسع [مونوكلونل] جسم (NS14)¹⁹ إلى ردات كابسيدس نوروفيروس سيدني GII.4 (جسيمات شبيهة بالفيروس أو فلبس) ومقارنة هذا للربط إلى هبجاس الاصطناعية. الابتامرات الحمض النووي هي قصيرة (nt ~ 20-80) واحد الذين تقطعت بهم السبل الأحماض النووية (ssDNA أو الحمض النووي الريبي) إضعاف في هياكل ثلاثية الأبعاد فريدة من نوعها نتيجة تسلسلها وربط هدفا. بسبب وجود الأحماض النووية، فأقل تكلفة؛ كيميائيا بسهولة تصنيعه، النقي، وتم التعديل؛ ومستقرة للحرارة. توجد عدة تقارير عن الابتامرات ولدت ضد نوروفيروسيس، مع بعض منهم عرض تفاعلية واسعة لمجموعة متنوعة من السلالات^18،20،،من²¹²². وعلى سبيل المثال، مور et al. ¹⁷ أظهرت أن ابتمر M6-2 منضم إلى نوروفيروس البشرية النقية، وتجميعها كابسيدس (فلبس)، وتصرفت على نحو مماثل إلى هبجا في الاعتماد على قفيصه الفيروسية للحفاظ على النظام (مثلاً، التعليم الثانوي والعالي) أعلى بروتين بنية ملزم تحدث. من ناحية أخرى، ظلت نسبة كبيرة من نوروفيروس عزام ملزمة لجسم NS14 بعد أن كانت كابسيدس التشويه والتحريف تماما. تقييم لربط نوروفيروس في دراسة مور et al. ¹⁷ تم استخدام طريقة بسيطة، والمستندة إلى لوحة شبيه أليسا، باستثناء أن الابتامرات تستخدم بدلاً من الأجسام المضادة (وبالتالي تم استدعاء الأسلوب العزة). تم استخدام هذا الأسلوب التجريبي إنتاجية عالية لتقييم آثار المعالجات المختلفة في قفيصه نوروفيروس، العمل الذي قيمة لفهم إليه المنظمة الفيروسية عند التعرض لعوامل الإجهاد الفيزيائية أو الكيميائية. ومع ذلك، هو عيب واحد إلى هذا الأسلوب أقل حساسية وعدم التسامح للملوثات المرتبطة بالمصفوفة في المستويات العليا التي تسبب غير محددة ملزمة الابتامرات.

مور et al. ¹⁷ استخدام أسلوب آخر، تناثر الضوء الحيوي (DLS)، لرصد تجميع الجزيئات الفيروسية في الاستجابة للمعالجة بالحرارة. يستخدم عادة لتقييم حجم تعليق نانوحبيبات DLS وامتد للبروتينات^23،24 والفيروسات^25،،من²⁶²⁷. كثافة الضوء المتناثرة من الجسيمات في حل يتقلب كدالة لحجم الجسيمات، مما يسمح لحساب معامل الانتشار، ومن ثم قطر الجسيمات باستخدام صيغ راسخة. يمكن التمييز بين تقنية DLS هيدرودينامية قطر الجسيمات المشتتة وصولاً إلى النانو، الذي يتيح الكشف عن الفيروسات مشتتة وبروتينات قفيصه الفردية أو dimers والمجاميع الفيروسات استناداً إلى حجم²⁷. تجميع الفيروسات، تمثل زيادة في حجم الجسيمات، ويدل على فقدان سلامة قفيصه. كما قفيصه هو التشويه والتحريف وعطلت هيكلها، بقايا مسعور أصبح عرضه وتسبب الجسيمات عصا معا وتشكيل المجاميع. يمكن استخدام دائرة الأراضي والمساحة لقياس حجم الجسيمات بعد علاج محدد أو الحركية للتجميع في الوقت الحقيقي^17،28. هذا الأسلوب له الميزة للسماح بمراقبة سلوك قفيصه في الحل ولكن يتطلب تركيزات عالية من قفيصه النقية، التي قد لا تكون ممثلة تماما للفيروس في حالته الطبيعية.

الأسلوب النهائي يستخدمها مور et al. وكان ¹⁷ مجهر إلكتروني (TEM). على الرغم من أن هذا الأسلوب يفتقر إلى الحساسية ولا تنتج بيانات كمية، فإنه يسمح لتصور آثار العلاجات المختلفة في هيكل قفيصه الفيروسية. على الرغم من أن ليست مثالية بعد لإعدادات السريرية والبيئة، استخدام هذه الأساليب في تركيبة قيمة في فهم المنظمة نوروفيروس البشرية. والغرض من هذه المقالة توفير بروتوكولات متعمقة مقايسة الربط القائم على لوحة (العزة)، دائرة الأراضي والمساحة، واستخدام أساليب إعداد تيم للتحقيق في آثار المعالجات الحرارية في قفيصه نوروفيروس في سياق الآثار العلاجات في قفيصه سلامة كما عرضت في مور et al. ¹⁷.