מגה-פלקס ציטוקין פרופיל של העכבר מגורה Splenocytes באמצעות פלטפורמה מבוססת-חרוז Cytometric מתכלה

כל הניסויים בוצעו על פי המלצות NIH הנכלל במדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה ואושרו על-ידי IACUC-BioLegend. איור 1: לסנן צלחת Assay הליך סיכום. הפרוטוקול עבור ביצוע וזמינותו באמצעות מסנן פלטות מיוצג דיאגרמה המתארת assay מפתח רכיבים ושלבים הדגירה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. 1. ביולוגי הכנת הדוגמא הערה: האתר האנטומי שבחרת ואת נפח של איסוף דם נשאר לשיקול דעתו הבלעדי של כל חוקר בודדים, לא ישפיעו על התוצאה של וזמינותו. עם זאת, ברגע שהם מתקבלים, דוגמאות צריך להיות מטופל לפי השלבים המפורטים להלן- הכנה של הדוגמאות סרום לאסוף את נפח הדם לתוך צינור אוסף המועדף הרצוי ולאפשר להיקרש במשך לפחות 30 דקות Centrifuge המדגם 10 דקות ב g x 1,000 בטמפרטורת החדר. להסיר בסרום ואת וזמינותו מיד או aliquot לתוך צינורות פוליפרופילן microcentrifuge ולאחסן דגימות-≤-20 ° C. הכנה של דגימות פלסמה לאסוף האחסון הרצוי של דם באמצעות חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA) מצופה צינורות איסוף דם. צנטריפוגה 10 דקות ב g x 1,000 בטמפרטורת החדר בתוך 30 דקות של אוסף. להסיר פלזמה ואת וזמינותו מיד, או aliquot לתוך צינורות פוליפרופילן microcentrifuge ולאחסן דגימות-≤-20 ° C. הכנה של תרביות רקמה Supernatant דגימות Centrifuge המדגם 10 דקות ב g x 1,500 ב 4 ° C כדי להסיר תאים ופסולת. לאסוף תגובת שיקוע ואת וזמינותו מיד או aliquot לתוך צינורות פוליפרופילן microcentrifuge ולאחסן ב ≤-20 ° C. מפשיר של קפוא דגימות ביולוגיות לחלוטין להפשיר כל דגימות ביולוגיות בעבר קפואים על קרח, ו מערבולת בקצרה לפני השימוש. להימנע יותר מ- 2 מחזורים ההקפאה/ההפשרה. הערה: הדגימות בשימוש פרוטוקול זה התקבלו על ידי culturing splenocytes העכבר BALB/c (1 x 10 6 תאים ב- C ° 37 + 5% CO 2 בתנאים שונים: unstimulated, LPS (100 ng/mL), αCD3 (1 µg/mL מצופים צלחת) + αCD28 (1 µg/mL מסיסים), ובחום (20 ng/mL) + Ionomycin (500 ng/mL). תרבות supernatants היו שנאספו לאחר 48 שעות ומעובדים כמתואר בסעיף 1.3. 2. הכנה ריאגנט חרוזים טרום מעורב חרוזים Preparation of Pre-mixed Antibody-Immobilized Sonicate בקבוקים עבור 1 דקות באמבט sonicator בטמפרטורת החדר, ועל מערבולת אז 30 s לפני השימוש. אם אין אמבטיה sonicator זמין, להגדיל את מערבולת הזמן מינימלית 1 הכנה של שטיפת מאגר מאגר שטיפת הבא ה-x 20 (20 x PBS עם 1% Tween-20) מסופק עם הקיט בטמפרטורת החדר, מערבולת להכניס מלחי כל פתרון. לדלל 25 מ ל 20 x מאגר לשטוף עם יונים 475 מ ל מים. חנות החלק בחיוב בין 2 ° C ל- 8 ° C עד לחודש אחד. הכנה של מטריקס B (עבור שימוש עם סרום, דגימות פלסמה בלבד) להוסיף mL 5.0 המאגר Assay (PBS עם 1% BSA) כלול בערכה של הבקבוק המכיל lyophilized מטריקס B. אפשר לפחות 15 דקות עבור reconst מלאה itution, ואז מערבולת לערבב היטב. ניתן לאחסן שאריות B מטריצה משוקם ב ≤-70 מעלות צלזיוס למשך חודש אחד עד. 3. הכנת תקן הערה: כל analyte בחלונית זו יש ריכוז רגיל העליון של 10,000 pg/mL. 250 להוסיף µL Assay המאגר כדי לשקם את lyophilized העכבר Th ציטוקין סטנדרטי קוקטייל. לערבב על ידי בקצרה vortexing ולאפשר את המבחנה תשב בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות להעביר את קוקטייל סטנדרטי צינור פוליפרופילן microcentrifuge הנקרא " C7 ". זה ישמש בתור העליון רגיל. תווית 6 צינורות פוליפרופילן microcentrifuge C6, C5, C4, C3, C2 ו C1- µL 75 להוסיף מאגר Assay לכל אחד הצינורות האלה. µL 25 העברה של C7 סטנדרטי העליון צינור C6 ולערבב היטב על ידי vortexing. . זה יהיה תקן C6. המשך ביצוע טורי דילולים 1:4 על-ידי שימוש pipet החדש של עצה לכל שפופרת להוסיף µL 75 Assay המאגר בצינור הבא הנמוך רגיל ואחריו vortexing 25 µL של תקן הקודם כדי להשיג סטנדרטים C5, C4, C3 , C2 ו C1. שימוש Assay מאגר תקן 0 pg/mL (C0). 4. לטעום דילול הערה: ניסויים פיילוט ראשוני שימוש assay הזה עם דילולים רבים העשויים להידרש כדי לקבוע את הגורם דילול המתאים ביותר עבור מסוימת של דגימות ביולוגיות. גורם לדילול ראוי יהיה לייצר ריכוז שהחישובים המדגם שנמצאים בתוך גבולות של העקומה סטנדרטי. השלבים הבאים נועדו כהנחיות, ייתכן שיקבע מדעית בהתאם לסוג דגימה. Dilute סרום או פלזמה דוגמאות קיפול כפול עם מאגר Assay (למשל-לדלל 50 µL מדגם עם 50 µL Assay המאגר) צינורות פוליפרופילן microcentrifuge. הערה: אם עוד יותר מדגם דילול נדרשת, דילולים צריך להיעשות עם מטריקס B במקום assay המאגר כדי להבטיח מדידה מדויקת. הוספת הדוגמאות סרום או פלזמה ללא דילול תגרום דיוק וזמינותו נמוכה, עלול לסתום את הצלחת מסנן. מטריקס B מורכב סרום העכבר במאגר של מטרות assay אנדוגני. הוא שימש דגימת נסיוב או פלסמה diluent כדי למנוע תופעות מטריקס, אשר ידועים משפיעים על רגישות אנליטית immunoassays. מבחן תא דגימות supernatant תרבות ללא דילול. הערה: הרמות של analyte יכול להשתנות במידה רבה מן הדגימה כדי מדגם. במידת הצורך, לדלל דגימות supernatant באמצעות הכנה טרי בינוני התרבות התא המתאים או מאגר Assay שלהם. 5. Assay הליך הערה: וזמינותו יכול להתבצע לוחות פוליפרופילן לסנן, מיקרו FACS צינורות או microplates V-התחתון. ההליך assay מסנן צלחת מומלץ בשל טוב הדגימה כדי מדגם עקביות assay חוסן, קלות הטיפול. הליך זה דורש יחידת סינון ואקום לרחצה (שסופק על-ידי משתמש הקצה). לאפשר ריאגנטים כל לחמם לטמפרטורת החדר (20-25 ° C) לפני השימוש. סט הלוחית מסנן כיסוי הפוכה בכל עת במהלך השלבים הדגירה וההתקנה assay, כך התחתון של הלוח אינו נוגע כל המשטחים שכן היא עלולה לגרום דולף. לקחת את הצלחת זקוף במהלך ההליך assay כולו, כולל את השלבים כביסה, כדי להימנע מאובדן חרוזים. לקחת את הצלחת כהה או עטוף ברדיד אלומיניום עבור כל שלבי הדגירה. לרוץ כל הסטנדרטים ודוגמאות ככפילות, מסודרים בצלחת סדר רציפים. מראש להרטיב את הצלחת מסנן על-ידי הוספת µL 100 1 x מאגר לשטוף כל טוב ולתת לו לשבת 1 דקות בטמפרטורת החדר (אם משתמשים microplate מסנן המדרגה). הסר מאגר אמצעי אחסון על-ידי שימוש של יריעה ואקום (5-10 s). לא יעלה על 10 " Hg של ואקום. שטיפת עודפי חשופה מאגר מהחלק התחתון של הלוח על ידי לחיצה על הצלחת על ערימת מגבות נייר נקי. מקם את הצלחת על גבי העטיפה צלחת הפוכה. הערה: השלבים 5.1-5.2 עשוי להיות מושמט אם מבצע את הבדיקה באמצעות של צינורות FACS V-התחתון microplate או מיקרו- עבור דגימות supernatant התרבות תאים, להוסיף 25 µL Assay מאגר כל בארות. להוסיף 25 µL ברמה כל הבארות סטנדרטי. להוסיף 25 µL של כל מדגם הבארות דגימה. למדידת הדוגמאות סרום או פלסמה, להוסיף 25 µL של מטריצה B הבארות סטנדרטי. להוסיף 25 µL Assay מאגר הבארות הדגימה. להוסיף 25 µL ברמה כל הבארות סטנדרטי. להוסיף 25 µL של כל סרום מדולל או פלאזמה מדגם הבארות דגימה. מערבולת מיקס חרוזי 30-ס’ 25 להוסיף µL של חרוזים מעורב כדי כל טוב, רועד חרוז בקבוק לסירוגין כדי להימנע חרוז ליישוב. עוצמת הקול הסופי צריך להיות µL 75 כל היטב לאחר התוספת של חרוזים. חותם לצלחת עם סילר לאיטום צלחת. לעטוף את הצלחת כולה, כולל את הכיסוי צלחת הפוכה, עם רדיד אלומיניום. מניחים את הצלחת על צלחת מטרף, לאבטח, ללחוץ על 500 סל ד עבור 2 h בטמפרטורת החדר. כדי למנוע דליפה, אינן חלות על לחץ אוויר חיובי חותם צלחת- ללא היפוך, למקם את הצלחת יריעה ואקום, חלים ואקום כמו קודם ולהוסיף µL 200 1 x שטיפת מאגר כל טוב. להסיר את התוכן של הבארות צלחת assay על ידי סינון ואקום. כתם שטיפת עודפי מאגר מתחתית לצלחת עם רכיב pad סופג או מגבות נייר. חזור על שלב זה עוד פעם אחת. הערה: אם וזמינותו מתבצע באמצעות FACS microplate או מיקרו של V-התחתון צינורות דלג על שלבים 5.12 ו 5.13. במקום centrifuge את הצלחת-1000 g x עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן תסיר את תגובת שיקוע באמצעות פיפטה רב-ערוצי. להוסיף 25 µL של נוגדנים זיהוי (ראה טבלה של החומרים) כל טוב. חותם לצלחת עם סילר לאיטום צלחת טריים. לעטוף את הצלחת כולה, כולל את הכיסוי צלחת הפוכה, עם רדיד אלומיניום- למקם את הצלחת על צלחת מטרף וללחוץ על 500 סל ד לשעה בטמפרטורת החדר. בלי לשאוב, להוסיף 25 µL של SA-PE ריאגנט ישירות אל כל טוב. ללא דילול של ריאגנט הכרחי. חותם לצלחת עם סילר לאיטום צלחת טריים. לעטוף את הצלחת כולה, כולל את הכיסוי צלחת הפוכה, עם רדיד אלומיניום- למקם את הצלחת על צלחת מטרף וללחוץ על 500 סל ד למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. חזור על שלב 5.13 הנ ל. µL להוסיף 200 1 x שטיפת מאגר לכל טוב. מחדש להשעות את החרוזים על מטרף צלחת עבור מינימלית 1 משתמש של pipet רב-ערוצי, להעביר דגימות מהצלחת מסנן FACS צינורות כדי לקרוא דוגמאות על cytometer זרימה. הערה: נפח דגימה עשוי להיות עלה מ 200 µL ל 300 µL על-ידי הוספת של µL 100 תוספת של 1 x מאגר לשטוף כל שפופרת כדי למנוע את הדגימה מוסיף להתייבש. אם ניתן לאחסן דגימות הכרחי 4 ° C מוגן מפני אור וניתח ביום המחרת. עם זאת, אחסון מדגם ממושך יכול להוביל אות מופחת. 6. זרימה Cytometer הגדרת הערה: על מנת להפיק נתונים אמין, cytometer זרימת חובה להגדיר אותה כהלכה לפני רכישת נתונים. תהליך זה ישתנו עבור משתמשים בודדים מסוימים בנוגע בהתאם לתצורת של המכשיר המסוים שוזמינותו מבוצעת על. תהליך ההתקנה מוכללת cytometer מסוגל למדוד PE ו- APC ומצוידים עם שניהם 488, 633 ננומטר לייזר נדונה להלן. הפעלת זרימת cytometer והשגה של התוכנה על פי היצרן ' s ההוראות שסופקו עם המכשיר- צור מגרש נקודה FSC (פיזור קדימה) על ה-x וציר האס (לצד פיזור) עבור ציר ה-y. הגדרת FSC ואת האס למצב לינארי. ליצור מגרש נקודה שנייה עם PE על ציר x ו APC עבור ציר ה-y. זו עלילה להגדיר מצב תצוגה מבוסס יומן. מערבולת הבקבוקון של חרוזים raw הכלולות בערכה ל 30 s מחדש להשעות את החרוזים. אלה חרוזים מכילים צבע פנימי של APC, מורכבות של שתי האוכלוסיות גודל. µL 400 העברה של חרוזים raw ל צינור FACS. להגדיר קצב הזרימה cytometer זרימה נמוכה. להפעיל את החרוזים raw, בזהירות התאמת מתח ורווח FSC, האס כך שתי האוכלוסיות בגודל של חרוזים אלה הם נפרדו בעליל, קל לשער. להתאים את הסף FSC כדי לא לכלול אירועים לא רצויים (כלומר פסולת או אוויר בועות). מגרש ב- FSC לעומת האס, לצייר שער הכולל כל האוכלוסיות חרוז. הערה: החרוזים raw מכילים שתי האוכלוסיות גודל חרוזים, והקטן יותר " חרוזים " וגדול יותר " B חרוז " אזורים. להציג את אוכלוסיות חרוז מגודרת מן העלילה FSC לעומת האס על המגרש נקודה שנייה עם PE על ציר x ו APC עבור ציר ה-y. להתאים את המתח PMT עבור הערוץ פלורסצנטיות APC כך האות APC עבור כל חרוז אוכלוסיות יש של עוצמת קרינה פלואורסצנטית החציוני (MFI) שנמצאת בין עונה 1 פרק 10 1 ו- 5 x 10 3. מערבולת הבקבוקון של PE ההתקנה חרוזים ב-30 s מחדש להשעות את החרוזים. µL 400 העברה של PE חרוזים על צינור FACS. החלף החרוזים raw צינור מ- cytometer זרימה עם PE חרוזים שפופרת. כוון את המתח צינור (PMT) האופטיקה PE פלורסצנטיות ערוץ בהגדרות כך MFI של חרוזים PE נופל בין הטווח ספציפיים רבים מצאו רשום על המבחנה חרוזים PE. הערה: החרוזים ההתקנה PE להכיל חרוזים של גודל האוכלוסייה אחת (" חרוזים " בלבד). 7. חדרי קירור והקפאה הערה: ההליכים המדויק המשויך רכישת נתונים על מכשיר מסוים יכול להשתנות, תלויים cytometer ' s תצורה מפרטים, ממשק התוכנה ששימשה. ההוראות הבאות נועדו ולכן לסמן את הפעולות הנדרשות מהסוגיא בחולין וזמינותו ללא קשר cytometer המועסקים וזמינותו. לאמת קצב הזרימה cytometer עדיין מוגדר לנמוך. להגדיר את מספר האירועים חרוז כדי לרכוש עד כ 300 לכל analyte. עבור 13-plex לוח זה משווה להשגת 3,900 אירועים בשילוב של שתי האוכלוסיות גודל חרוז (A + B חרוזים). מערבולת כל דגימה עבור 5 s לפני ניתוח. דוגמאות לקריאה. בעת קריאת דגימות, להגדיר את cytometer זרימה במצב התקנה קודם ולחכות עד חרוז האוכלוסייה התייצב לפני המעבר למצב רכישת. להשתמש בשמות פשוטים עם מספור רציף עבור קבצי נתונים כדי להקל על ניתוח נתונים. לייצא רק את האירועים מגודרת (A + B חרוז אזורים) במקום אירועים סה כ. לאחסן כל FCS הקבצים באותה תיקיה עבור כל וזמינותו. אם הפעלת מבחני מרובים, ליצור תיקייה נפרדת עבור כל assay.

8. המשך ניתוח נתונים הערה: FCS הקבצים שנוצרו ב- cytometer הזרימה צריך להיות מנותח באמצעות תוכנת ניתוח של נתונים, אשר ניתן להוריד בחינם 14. להתקין את תוכנת ניתוח נתונים ב- PC- להעביר את כל הקבצים assay FCS למחשב שמכיל את תוכנת ניתוח. לחבר את הדונגל מפתח רשיון (כלול בערכה) ליציאת USB של המחשב. להפעיל את תוכנת ניתוח נתונים. לחץ על הכחול " הוסף קבצים " הכפתור ממוקם בחלק העליון של המסך. נווט אל התיקיה שמכילה את הקבצים FCS וזמינותו ב מוקצפים חלון שמופיע. לחץ, גרור כל הקבצים assay FCS למעלה חלון פופ כדי להציג את תוכנה. כל הקבצים עכשיו אמור להופיע ברשימה. לחץ הירוק " הבאה " הלחצן בפינה הימנית התחתונה של התצוגה. שמאל לחץ והחזק כדי לגרור הקטן עיקול רגיל כחול כפתורים (C7 ל C0) לקבצים שלהם-FCS המתאימה מתוך הרשימה כדי להגדיר את עקומת סטנדרטי. לחץ הירוק " הבאה " הלחצן בפינה הימנית התחתונה של התצוגה כדי לפתוח חסימה למעלה חלון פופ- בצד שמאל של החלון המגביל הזן את השמות של שני ה-A ו- B חרוז אזורים assay מטרות analyte ומזהה חרוז המשויך שלהם (נמצא במדריך המצורף וזמינותו) עולה. בחרו בכלי המגביל מהחלק העליון של למעלה חלון פופ ולהשתמש בו כדי לצייר 2 שערים בהמשך העלילה FSC לעומת האס, בסביבה החרוזים A אחת, שנייה סביב החרוזים B. לסקור את APC לעומת PE פיזור מתווה המופיעים להלן העלילה FSC לעומת האס המופיעות. יהיו להקות analyte 6 ב החרוזים A (מגרש השמאלי) ולהקות analyte 7 ב החרוזים B (נכון עלילה). הערה: השערים עלול לצייר באופן ידני על-ידי בחירת הכלי מחק בראש ולחיצה כדי למחוק נתון שער. הכלי המגביל ייתכן ואז נבחר ויש להשתמש כדי להחיל באופן ידני שער האזור הרצוי הלהקה. לחץ הירוק " אישור " כפתור כדי לסגור למעלה חלון פופ המגביל ולחזור לרשימת הקבצים FCS. להגדיר כל דילולים שנעשו על דגימות ביולוגיות בזכות לחיצה על קובץ נתון, בחירת " דילול לקפל " מן התפריט, והוא קלט הערך הנכון. לחץ הירוק " לרוץ " לחצן בפינה הימנית התחתונה של התצוגה כדי להפיק את עקומות סטנדרטי עבור וזמינותו ולחשב את ריכוזי דגימות ביולוגיות לא ידוע.