Überexpression und Reinigung des Menschen<em> Cis</em> -prenyltransferase in<em> Escherichia coli</em
Summary
Ein einfaches Protokoll zur Überexpression und Reinigung von codonoptimierter, menschlicher cis- Prenyltransferase unter nicht-denaturierenden Bedingungen aus Escherichia Coli , wird zusammen mit einem enzymatischen Aktivitäts-Assay beschrieben. Dieses Protokoll kann für die Produktion von anderen cis- Prenyltransferase- Proteinen in Quantität und Qualität geeignet für mechanistische Studien verallgemeinert werden.
Abstract
Prenyltransferasen (PT) sind eine Gruppe von Enzymen, die die Kettenverlängerung von Allyldiphosphat unter Verwendung von Isopentenyldiphosphat (IPP) über mehrere Kondensationsreaktionen katalysieren. DHDDS (Dehydrodolichyldiphosphatsynthase) ist ein eukaryotisches langkettiges cis- PT (bildende cis -Doppelbindungen aus der Kondensationsreaktion), das die Kettenverlängerung von Farnesyldiphosphat (FPP, ein allylisches Diphosphat) über mehrere Kondensationen mit Isopentenyldiphosphat (IPP) katalysiert. DHDDS ist von biomedizinischer Bedeutung, da eine nicht-konservative Mutation (K42E) im Enzym zu Retinitis pigmentosa führt , was letztlich zur Blindheit führt. Daher wurde das vorliegende Protokoll entwickelt, um große Mengen an gereinigtem DHDDS zu erwerben, die für mechanistische Studien geeignet sind. Hier wurden die Verwendung von Proteinfusion, optimierten Kulturbedingungen und Codonoptimierung verwendet, um die Überexpression und Reinigung von funktionell aktivem humanem DHDDS in zu ermöglichen <eM> E Coli Das beschriebene Protokoll ist einfach, kostengünstig und zeitsparend. Die Homologie von cis- PT unter verschiedenen Spezies deutet darauf hin, dass dieses Protokoll auch für andere eukaryotische cis- PT angewendet werden kann, wie jene, die an der Naturkautschsynthese beteiligt sind.
Introduction
Prenyltransferasen sind eine Gruppe von Enzymen, die die Kettenverlängerung von Allyl-Diphosphat unter Verwendung von Isopentenyldiphosphat (IPP) über mehrere Kondensationsreaktionen 1 , 2 katalysieren. Z-Typ – Enzyme katalysieren die Bildung von cis – Doppelbindungen aus der Kondensationsreaktion, wohingegen E-Typ – Enzyme 3 trans – Doppelbindungsbildung katalysieren. Cis- Prenyltransferasen ( cis- PT, Z-Typ-Enzyme) werden klassisch nach ihrer Produktkettenlänge in kurzkettige (C 15 ), mittelkettige (C 50-55 ) und langkettige (C 70-120 ) klassifiziert ) 4 . DHDDS (Dehydrodolichyldiphosphatsynthase) ist ein eukaryotisches langkettiges cis- PT, das die Kettenverlängerung von Farnesyldiphosphat (FPP, ein allylisches Diphosphat) über mehrere Kondensationen mit Isopentenyldiphosphat (IPP) 1 katalysiert, 5 , 6 Dies führt zu der Bildung von dehydrodolichyl Diphosphat, ein C 55-100 Polyprenyldiphosphat als Vorstufe für dolichylpyrophosphate dien Molekül des Glycosyl Träger beteiligt in N-verknüpften Proteinglykosylierung 1. Unter den ashkenazischen Juden führt eine nicht-konservative Mutation (K42E) in DHDDS zu einer autosomal-rezessiven Retinitis pigmentosa 7 , 8 . Daher wurde das vorliegende Protokoll entwickelt, um gereinigtes DHDDS für mechanistische Studien zu erwerben.
Escherichia coli gilt als der bequemste und kostengünstigste Wirt für die rekombinante Proteinexpression und ist daher auch der am häufigsten verwendete Wirt. Wenn man jedoch versucht, die Proteine in E. coli heterolog zu überexprimieren, sollten proteinspezifische Überlegungen gemacht werden. Gewinnung richtig gefaltet, aktivE rekombinante Proteine aus E. coli , ist aufgrund der unterschiedlichen Eigenschaften verschiedener Proteine keine einfache Sache. Zahlreiche Ansätze wurden entwickelt, um diese Hürden zu überwinden. Hier wurden die Verwendung von Proteinfusion, optimierten Kulturbedingungen und Codonoptimierung verwendet, um die Überexpression und Reinigung von funktionell aktivem humanem DHDDS in E. coli zu ermöglichen . Der vorherige Versuch, die Hefe cis- PT ohne Proteinfusion zu überexprimieren, war aufgrund der vollständigen Unlöslichkeit auch in Gegenwart des Detergens 12 nicht erfolgreich . Das beschriebene Protokoll ist einfach, kostengünstig, zeitsparend und erlaubt es, DHDDS-Präparate zu erhalten, die für mechanistische Studien geeignet sind. Angesichts der Homologie von cis- PT unter verschiedenen Spezies schlagen wir vor, dass dieses Protokoll auch für andere eukaryotische cis- PT angewendet werden kann.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das hier beschriebene Protokoll zur Reinigung von funktionellen humanen DHDDS in E. coli- Zellen ist einfach und effizient, so dass man das Protein in 3 – 4 Tagen überexprimieren und reinigen kann, sobald ein geeignetes Konstrukt vorliegt. Solche Protokolle für die Proteinreinigung sind bei den Durchbrüchen in der Genomsequenzierung von besonderer Bedeutung, die eine Fülle von Informationen über die Genetik vieler Krankheiten 18 lieferte und damit die Entwicklung von Hochdurchsatzme…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde gefördert durch das Zentrum für Forschungs-Exzellenz der Israelischen Wissenschaftsstiftung (I-CORE) in der Strukturzellbiologie (1775/12) und die Israelische Wissenschaftsstiftung 1721/16 und 2338/16 (YH) und 825/14 (DK ). Die Unterstützung der Fields Estate Foundation an DK wird sehr geschätzt. Diese Arbeit wurde von Ilan Edri und Michal Goldenberg in Teilerfüllung der MD-Thesis-Anforderungen der Sackler Fakultät für Medizin, Tel Aviv Universität durchgeführt.
Materials
| pET-32b | Novagen | 69016-3 | |
| T7 Express lysY Competent E. coli (High Efficiency) | NEB | C3010I | |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| TALON-superflow resin | GE Healthcare | 28-9574-99 | |
| HiPrep 26/10 desalting column | GE Healthcare | 17508701 | |
| HiLoad 16/60 superdex-200 | GE Healthcare | 28989335 | |
| superdex-200 increase 5/150 GL | GE Healthcare | 28990945 | |
| 14C-Isopentenyl pyrophosphate | Perkin-Elmer | NEC773050UC | |
| trans,trans-Farnesyl pyrophosphate | Sigma | 44270-10MG |
References
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