Caracterização estrutural de polissacarídeos de parede celular Medeiros em plantas usando a ritmo

1. colheita de Material vegetal colher material de planta fresco (~ 20 mg) e, imediatamente, submirja em etanol a 96% (v/v) e incubar a 70 ° C por 30 min; isto desativa qualquer parede celular presentes enzimas degradantes. Para material seco, comece pela etapa 2. Cuidado: O álcool etílico é inflamável. Nota: Uma única folha de haste ou Roseta irá fornecer material suficiente para análise. No entanto, menos erros surgirem se uma maior quantidade de tecido é agrupada e analisada desde que isto é mais fácil para pesar e lidar com. Registrar cuidadosamente o tipo de tecido e grau de desenvolvimento, como estrutura de polissacarídeo varia com os dois. Por exemplo, com Arabidopsis thaliana (usado aqui), fase o tecido de acordo com os métodos de Boyes et al 15 Nota: Este protocolo, usamos a metade inferior da haste da inflorescência, onde a primeira síliqua é totalmente alongada mas não amarelamento. 2. preparação de álcool insolúvel resíduo (ar) preparar ar, seguindo o método de Mortimer et al 9 ou outro método semelhante, a fim de produzir um pó falta de açúcares solúveis, como sacarose e amido. 3. Alíquotas e pré-tratamento de ar Nota: A quantidade exata de ar necessária para cada amostra dependerá do (a) a abundância do polissacarídeo de interesse no material e (b) o tamanho médio dos oligossacarídeos, lançado pela o GH. O método adiciona uma molécula fluorescente ao final de cada oligossacarídeo, reduzindo assim o número de oligossacarídeos determina a sensibilidade do experimento. Como uma diretriz, para glucomannan no tronco de Arabidopsis digerido com GH5/GH26 (como descrito), 500 µ g é recomendado 11, Considerando que para xilana em tronco de Arabidopsis digerido com GH11, recomenda-se 100 µ g como em Mortimer ' estudo s 3. pesa ar (10-15 mg) em um tubo de centrífuga de 15 mL e adicionar H 2 O a uma concentração final de 2 mg/mL. Vórtice para conseguir uma suspensão mesmo. Se isto é problemático, usar um homogeneizador de vidro para ajudar neste processo. Tubos alíquota 500 µ g em microcentrífuga. Alíquotas utilizando uma centrífuga a vácuo a seco (veja a Tabela de materiais) durante a noite em 30 ° C. Pré-tratamento de ar com 1 M de NaOH (20 µ l) por 1h à temperatura ambiente; isto de acetylates os polissacarídeos e incha as microfibrilhas de celulose, rompendo a estrutura de biomassa e permitindo o acesso de GH. Nota: Este passo pode ser ignorado para polissacarídeos purificados. Cuidado – ácido/base forte. Incluem uma alíquota para um controle de ar não-enzimática (tratados da mesma forma como todas as amostras, exceto passo 4.1. é excluído). Adicionar 200 µ l de H 2 O e 20 µ l 1m HCl para neutralizar. Teste que o pH é ~ 6-7, removendo 1 µ l e mancha-lo em tiras de papel indicador de pH. De amónio de 1m adicionar 50 µ l de tampão de acetato, pH 6.0 (ou qualquer que seja o pH é apropriado para o GHs utilizado no estudo) e H 2 O para dar um volume total de 500 µ l. Nota: Acetato de amônio é usado desde que sublima-se após a secagem, e então não adiciona sal adicional à amostra. Um excesso de sal pode levar a banda-forma pobre e resolução sobre o gel ritmo. 4. Hidrólise do ar com Glycosyl Hydrolases (GHs) Nota: como mencionado na discussão, a pureza do GHs é crítica. Use somente heterologously expressado, afinidade purificado de enzimas. Após o recebimento de cada lote do fabricante, hidrolisar alíquotas definidas de substrato (por exemplo, 500 µ g ar) com o aumento da quantidade de GH durante a noite (por exemplo, 0.5, 1, 2, 5, 10, 15, 20 µ l) (3 unidades / µ l). Quando há um excesso de GH, a impressão digital ritmo vai olhar idêntico. Um excesso de enzima é necessário para entregar um resultado reprodutível, porque deve estar certo de que a reação de hidrólise aproxima-se o ponto de extremidade. Controle Adicionar uma quantidade pré-determinada (veja acima), de mannanases (GH5 e GH26 11) para as alíquotas de ar no buffer da etapa 3.5, bem como um positivo (30 µ g de glucomannan konjac) e um controle negativo não-ar (mistura de enzima em um tubo vazio). Vórtice e em seguida girar brevemente para recolher a mistura de reação no fundo do tubo. Incubar durante uma noite a 37 ° C (ou a temperatura apropriada para o GH de escolha), com agitação suave (~ 100 rpm). Parar a reação incubando a 95 ° C por 20 min. Nota: Tampas de Cap podem ser usadas para selar os tubos de microcentrífuga flip-top. Centrífuga usando uma microcentrífuga de bancada superior na velocidade máxima por 10 min e reter sobrenadante. Resuspenda o pellet em 250 µ l H 2 O, centrífuga como acima e reter sobrenadante. Combinar ambos os sobrenadantes e seque em uma centrífuga a vácuo (veja a Tabela de materiais) a 30 ° C (~ 3 h ou durante a noite sem aquecimento). 5. Elaboração de normas Oligosaccharide estoque de 1 mM de preparar soluções em H 2 O da manose (homem), mannobiose (homem 2), mannotriose (Man 3), mannotetraose (homem 4), mannopentaose (homem 5) e mannohexaose (homem 6), todos os β, 1-4 ligados. Alíquota e loja a-20 ° C até necessário. Preparar 3 diferentes concentrações de um homem mistura de 1-6, combinando 1 µ l (padrão S1), 2 µ l (S2) ou 5 µ l (S3) de todos os seis. Seco em uma centrífuga a vácuo (ver Tabela de materiais) a 30 ° C (~ 1 h). 6. Derivitization de oligossacarídeos Prepare uma solução stock de formigas de 0,2 M (ácido 8-aminonaftaleno-1,3,6-trisulfonic) em H 2 O: ácido acético 17:3. Estoque quente a 60 ° C para dissolver completamente o sólido. Loja a-20 ° C, protegido da luz, por 2-3 meses. Prepare uma solução stock de 0,2 M de 2-picolina borano (2-PB) em DMSO. Isto é extremamente higroscópico, resuspenda então imediatamente todo o pó em cima do recibo em DMSO. Alíquota e loja a-20 ° C durante 1-2 anos. Descongelar as alíquotas como necessária (loja a 4 ° C, durante 2 semanas e em seguida descarte). Preparar o buffer de derivatização de H 2 O: ácido acético: DMSO às 17:03:20. Para cada amostra, adicionar 5 µ l de formigas, 5 µ l de 2-PB e 10 µ l de tampão de derivatização. Spin brevemente para coletar no fundo do tubo, vórtice completamente e em seguida girar rapidamente novamente. Veja a Figura 1 para descrição de reação. Amostras de incubar durante a noite a 37 ° C, protegido da luz. Seco em uma centrífuga a vácuo (ver Tabela de materiais) a 30 ° C (~ 2 h). Ressuspender amostras e padrão em ureia de 3M 100 µ l. Loja a-20 ° C, protegida da luz até necessária. 7. Gel de preparação do ritmo Nota: montagem do equipamento de fundição de gel vai depender da marca. Aqui, nós use um sistema de eletroforese vertical (ver Tabela de materiais), equipado com placas de vidro de 18 x 24 cm e 1,5 mm espaçadores. Montar equipamento de fundição de gel pelo fabricante ' instruções de s. Buffer de ritmo make x 10 (1 M Tris-borato pH 8,2) como segue: Adicionar 121,14 g de Tris-Base a ~ 400 mL de H 2 O e misture para dissolver. Ajustar o pH a 8.2 por adição de ácido bórico sólido (cerca de 60 g) e em seguida fazem o volume até 1 L. Fazer um 10% (p/v) de amônio persulfato (APS) estoque em H 2 O. alíquota e armazenar em alíquotas de degelo-20 ° C. uma vez, armazenar a 4 ° C e descartar depois de 2 semanas. Fazer e despeje o gel de resolução. Para os equipamentos acima, 1 gel equivale a 50 mL. Em um tubo de centrífuga de 50 mL, misture H 2 O (20,2 mL), 5 mL x 10 ritmo de tampão, 24,6 mL 40% acrilamida/Bis-acrilamida (29:1 acrylamide:Bis). (Atenção: tóxico). Adicionar 200 µ l de APS e 20 µ l de N, N, N, N´-tetrametil-etilenodiamina (TEMED). Inverta suavemente para misturar (para evitar a introdução de bolhas de ar). Despeje o gel usando um serológicos ou outra pipeta de grande volume, a ~ 4 cm abaixo do topo das placas de vidro. Preste atenção para a possibilidade de ficar preso no gel de bolhas de ar. Se eles fazer, parar de derramar e inclinação/torneira o gel para soltá-los. Sobrepor o gel com isopropanol (inflamável de precaução :) ou, cuidadosamente, com H 2 Allow O. gel para polimerizar (20-30 minutos) e, em seguida, despeje a camada superior. Se isopropanol foi usado, em seguida, lave 2 x com H 2 O. Dry qualquer excesso de líquido usando papel mata-borrão. Fazer e despeje o gel de empilhamento. Misture 6,8 mL H 2 O, 1 mL de tampão de ritmo x 10, 2,8 mL acrilamida/Bis-acrilamida (PRECAUÇÃO: tóxico), 80 µ l APS e 8 µ l de TEMED em um tubo de centrífuga de 15 mL. Inverter para misturar e sobrepor em cima do gel de resolução polimerizado. Introduza cuidadosamente os pentes, evitando armadilhas bolhas de ar sob os dentes do pente. Gel de permitir a polimerizar (20-30 min), embrulhe em tecido úmido e em seguida em filme plástico e armazenar a 4 ° C até necessária. Loja com os pentes no lugar. Nota: Ritmo géis podem ser armazenados por um período máximo de 2 semanas (embora menos de 1 semana é o ideal), se eles são mantidos húmidos. 8. Executando um ritmo Gel usar um marcador permanente para rotular as posições bem no vidro, que ajudarão a manter o controle de ordem de carregamento, e na identificação de onde os poços são uma vez que o pente é removido. Remover o pente. Encher os poços com buffer de ritmo 1 x. Usar um 10 µ l micro-seringa carregar 2 µ l de padrões e amostras em poços. Evite usar as pistas mais externa, que tendem a executar amostras mal. Montar a câmara superior do aparato gel de execução e colocar o gel em um tanque de refrigeração (~ 10 ° C) execução (10 ° C), contendo 1 x ritmo buffer. Encha a câmara superior com buffer de ritmo 1 x. Ligue o poder e executar o gel a 200 V (constante V) por 30 minutos e depois aumento da tensão de 1000 V para 1 h 40 min. Proteger os geles de luz (por exemplo, envolvendo tanques em sacos de lixo preto). Nota: Verificar os géis ~ 5 min depois de ligar a tensão e depois mais 5 min. depois de um aumento da tensão de 1.000 V. Se a bateria é incapaz de manter a tensão, então provavelmente existe um vazamento de reserva. Remova o gel do tanque. Volte a montar a câmara superior, cuidadosamente verificando o posicionamento de todas juntas. Um chip grande na borda superior da placa de vidro pode impedir a placa formando uma boa vedação com a junta. Isso geralmente pode ser temporariamente resolvido adicionando uma gota de agarose fundido de 5% (p/v) para a parte lascada do vidro, antes de adicionar a câmara superior. 9. Visualizando um gel de ritmo Nota: Use um gel sistema equipado com lâmpadas de UV de ondas longas no transiluminador e um filtro de emissão para a câmera que é apropriado para o fluoróforo, aqui 530 nm de imagem. Alternativamente, um scanner a laser também pode ser utilizado, conforme descrito em Goubet 2. Certifique-se de gel sistema de imagem é livre de poeira, limpando-a com tecido úmido fiapos. Remover o gel do tanque de ritmo e ver os brevemente, enquanto que o gel é ainda nas placas de vidro (< 80 ms) para determinar se a frente de tintura é ainda no gel. Abrir o gel usando uma ferramenta de cunha e enquanto o gel é ainda na placa de um vidro, use um cortador de pizza para remover tanto o gel de empilhamento e, se a frente de tintura é ainda no gel, parte inferior do gel. Coloque a superfície do transiluminador ~ 5 mL H 2 O e depois transferir o gel diretamente sobre o transiluminador. Definir o filtro de UV 605 e ative o transiluminador UV de ondas compridas (ver Tabela de materiais) usando o software. Nota: O formigas fluoróforo usado aqui tem uma excitação/emissão de 353/520 nm. Tirar várias fotos em vários tempos de exposição (por exemplo, 100 ms a 10 s). Certifique-se de que a luz UV é desligada entre imagens clicando no botão de luz de UV (para desligá-lo) para evitar a degradação da fluorescência. Garantir que pelo menos 2 das imagens não saturadas bandas (o gel software de imagem irá indicar isto). Salve arquivos como imagens de alta-resolution.tif. Nota: Imagens podem ser analisadas usando o software fornecido com o sistema de imagem de gel, ou usando o software de análise de imagem livremente disponíveis, tais como ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/). Consulte a seção de resultados para uma discussão de quantificação.