Caratterizzazione strutturale di Mannan polisaccaridi di parete cellulare nelle piante usando passo

1. raccolta di materiale vegetale raccolto materiale vegetale fresco (~ 20 mg) e immediatamente immergerlo in etanolo al 96% (v/v) e incubare a 70 ° C per 30 min; questo disattiva qualsiasi parete cellulare presenti enzimi degradativi. Per materiale secco, iniziare dal passaggio 2. Attenzione: L’etanolo è infiammabile. Nota: Una singola foglia di staminali o Rosetta fornirà abbastanza materiale per l’analisi. Tuttavia, meno errori derivano se una maggiore quantità di tessuto è riunite e analizzate dal momento che questo è più facile da pesare e gestire. Registrare accuratamente tessuto tipo e Stadio di sviluppo, come struttura di polisaccaride varia con entrambi. Ad esempio, con thaliana di Arabidopsis (usato qui), fase il tessuto secondo i metodi da Boyes et al. 15 Nota: nel presente protocollo, abbiamo usato la metà inferiore del fusto infiorescenza, dove il primo anemofila è completamente allungato ma non ingiallimento. 2. residuo insolubile preparazione dell’alcool (aria) preparare aria, seguendo il metodo di Mortimer et al. 9 o un altro metodo simile, al fine di produrre una polvere priva di zuccheri solubili, come saccarosio e amido. 3. Aliquotare e pre-trattamento dell’aria Nota: l’esatta quantità di aria necessaria per ogni campione dipenderà (a) l’abbondanza di polisaccaride di interesse nel materiale e (b) la dimensione media degli oligosaccaridi rilasciato da il GH. Il metodo aggiunge una singola molecola fluorescente alla fine di ogni oligosaccaride, riducendo così il numero degli oligosaccaridi determina la sensibilità dell’esperimento. Indicativamente, per glucomannano in Arabidopsis staminali digerito con GH5/GH26 (come descritto), 500 µ g è consigliato 11, considerando che per xilano in Arabidopsis staminali digerito con GH11, 100 µ g è raccomandato come Mortimer ' Studio s 3. pesare aria (10-15 mg) in una provetta da centrifuga 15 mL e aggiungere H 2 O a una concentrazione finale di 2 mg/mL. Vortice per ottenere una sospensione anche. Se questo è problematico, quindi utilizzare un omogeneizzatore di vetro per aiutare questo processo. Aliquot 500 µ g in microfuge tubi. Asciugare le aliquote utilizzando una centrifuga vuoto (Vedi la Tabella materiali) durante la notte a 30 ° C. Pre-trattamento aria con 1 M NaOH (20 µ l) per 1 h a temperatura ambiente; questo de-acetila i polisaccaridi e gonfia le microfibrille di cellulosa, interrompendo la struttura di biomassa e consentendo l’accesso di GH. Nota: Questo passaggio può essere ignorato per polisaccaridi purificati. ATTENZIONE – forte acido/base. Includono un’aliquota per un controllo di aria no-enzima (trattati allo stesso modo come tutti i campioni, eccetto il passaggio 4.1. è escluso). Aggiungere 200 µ l di H 2 O e 20 µ l 1 M HCl per neutralizzare. Prova che il pH è ~ 6-7 rimuovendo 1 µ l e spotting sulla carta nastri di indicatore di pH. Tampone di acetato di ammonio 1 M di aggiungere 50 µ l di , pH 6.0 (o qualunque pH è appropriato per il GHs utilizzato nello studio) e H 2 O per ottenere un volume totale di 500 µ l. Nota: Acetato di ammonio è usato poiché esso sublima durante l’essiccazione, e quindi non aggiunge ulteriori sale al campione. Un eccesso di sale può portare a scarsa forma di banda e ad alta risoluzione sul gel ritmo. 4. Idrolisi dell’aria con Glycosyl Hydrolases (GHs) Nota: come accennato nella discussione, la purezza del GHs è critica. Utilizzare solo heterologously espressi, enzimi purificate per affinità. Al ricevimento di ogni lotto dal produttore, idrolizzano le aliquote definite di substrato (ad es., 500 µ g aria) con aumento della quantità di GH durante la notte (ad esempio, 0,5, 1, 2, 5, 10, 15, 20 µ l) (3 unità / µ l). Quando c’è un eccesso di GH, l’impronta PACE avrà un aspetto identico. Un eccesso di enzima è necessario per fornire un risultato riproducibile perché deve essere certo che la reazione di idrolisi si sta avvicinando l’endpoint. Aggiungi un importo predeterminato (Vedi sopra) di mannanases (GH5 e GH26 11) per le aliquote di aria nel buffer da passo 3.5, nonché un positivo controllo (30 µ g di glucomannano di konjac) e un controllo negativo no-aria (enzima mix in un tubo vuoto). Vortice e spin poi brevemente a raccogliere la miscela di reazione nella parte inferiore del tubo. Incubare per una notte a 37 ° C (oppure la temperatura appropriata per il GH di scelta) con movimentazione delicata (~ 100 giri/min). Fermare la reazione incubando a 95 ° C per 20 min. Nota: Le chiusure Cap possono essere utilizzate per sigillare tubi del microfuge flip-top. Centrifugare utilizzando un panca superiore microfuge alla massima velocità per 10 min e conservare il surnatante. Risospendere il pellet in 250 µ l di H 2 O, centrifuga come sopra e conservare il surnatante. Combinare entrambi i surnatanti e asciugare in una centrifuga vuoto (Vedi la Tabella materiali) a 30 ° C (~ 3 h o durante la notte senza riscaldamento). 5. Preparazione di standard di oligosaccaride magazzino di 1 mM di preparare soluzioni in H 2 O di mannosio (uomo), mannobiose (Man 2), mannotriose (Man 3), mannotetraose (Man 4), mannopentaose (Man 5) e mannohexaose (Man 6), tutti i β, 1-4 collegati. Aliquotare e conservare a-20 ° C fino a quando richiesto. Preparare 3 diverse concentrazioni di un uomo 1-6 miscela combinando 1 µ l (Standard S1), 2 µ l (S2) o 5 µ l (S3) di tutti e sei. Secco in una centrifuga vuoto (Vedi Tabella materiali) a 30 ° C (~ 1 h). 6. Derivitization di oligosaccaridi preparare una soluzione stock di 0,2 M formiche (acido 8-amminonaftalen-1,3,6-trisulfonic) in H 2 O: acido acetico 17:3. Brodo caldo a 60 ° C per sciogliere completamente il solido. Conservare a-20 ° C, al riparo dalla luce, per 2-3 mesi. Preparare una soluzione stock di 0,2 M di 2-Picolina borano (2-PB) in DMSO. Questo è estremamente igroscopico, quindi immediatamente risospendere tutta polvere al ricevimento in DMSO. Aliquotare e conservare a-20 ° C per 1-2 anni. Disgelare aliquote come richiesto (conservare a 4 ° C per 2 settimane e poi scartare). Preparare il tampone di derivatizzazione di H 2 O: acido acetico: DMSO alle 17:03:20. Per ogni campione, aggiungere 5 µ l di formiche, 5 µ l di 2-PB e 10 µ l di tampone di derivatizzazione. Spin brevemente per raccogliere sul fondo del tubo, vortice accuratamente e poi girare di nuovo brevemente. Vedere la Figura 1 per reazione descrizione. Incubare i campioni durante la notte a 37 ° C, al riparo dalla luce. Secco in una centrifuga vuoto (Vedi Tabella materiali) a 30 ° C (~ 2 h). Risospendere campioni e standard in 100 µ l 3 M urea. Conservare a-20 ° C, al riparo dalla luce fino a quando richiesto. 7. Preparazione del ritmo gel Nota: montaggio dell’attrezzatura di colata di gel dipenderà molto il marchio. Qui, abbiamo uSe un sistema di elettroforesi verticale (Vedi Tabella materiali), dotato di distanziali lastre di vetro di 18 x 24 cm e 1,5 mm. Montare l’attrezzatura della colata gel per il produttore ' istruzioni s. Buffer di ritmo di 10 x make (1 M Tris-borato, pH 8.2) come segue: aggiungere 121,14 g di Tris-Base a ~ 400 mL di H 2 O e mescolare per sciogliere. Aggiustare il pH a 8.2 mediante aggiunta di acido borico solido (circa 60 g) e quindi rendere il volume fino a 1 L. Fare un 10% (p/v) di ammonio persolfato (APS) magazzino H 2 O. aliquota e memorizzare una volta alle aliquote di disgelo di-20 ° C., conservare a 4 ° C e scartare dopo 2 settimane. Fare e versare il gel di risoluzione. Per l’attrezzatura di cui sopra, 1 gel equivale a 50 mL. In una provetta da centrifuga 50 mL, mescolare H 2 O (20,2 mL), 5 mL di tampone per ritmo 10x, 24,6 mL 40% di acrilammide/Bis-acrilammide (29: 1 acrylamide:Bis). (Attenzione: tossici). Aggiungere 200 µ l di APS e 20 µ l di N, N, N, n-tetrametil-etilendiammina (TEMED). Invertire delicatamente per mescolare (per evitare di introdurre bolle d’aria). Versare il gel utilizzando un sierologici o altri pipetta di grande volume, a ~ 4 cm sotto la parte superiore delle lastre vetrate. Prestare attenzione alla possibilità di essere intrappolati nel gel le bolle d’aria. Se essi fare, smettere di versare e tilt/toccare il gel per liberarli. Il gel con isopropanolo (infiammabile cautela :) o, con attenzione, con H 2 O. Consenti gel per polimerizzare (20-30 minuti), poi versare lo strato superiore di overlay. Se è stato utilizzato isopropanolo, quindi lavare 2x con H 2 O. a secco liquido in eccesso con carta assorbente. Fare e versare il gel d’impilamento. Mix di 6,8 mL H 2 O, 1 mL di tampone di ritmo 10x, 2,8 mL acrilammide/Bis-acrilammide (Attenzione: tossici), 80 µ l APS e 8 µ l di TEMED in una provetta da centrifuga da 15 mL. Inverti per mescolare e overlay sopra gel polimerizzato di risoluzione. Inserire delicatamente pettini, evitando bolle d’aria intrappolamento sotto i denti del pettine. Consenti gel per polimerizzare (20-30 min.), avvolgere in tessuto umido e poi nella pellicola trasparente e conservare a 4 ° C fino a quando richiesto. Negozio con i pettini in luogo. Nota: Ritmo gel possono essere memorizzati per un massimo di 2 settimane (anche se meno di una settimana è l’ideale), se sono mantenuti umidi. 8. In esecuzione di un ritmo Gel utilizzare un pennarello indelebile per etichettare le posizioni bene sul vetro, che aiuterà a tenere traccia di ordine di caricamento, e nell’individuare dove i pozzi sono una volta rimosso il pettine. Rimuovere il pettine. Riempire i pozzetti con buffer di ritmo di 1 x. Utilizzare un 10 µ l microsiringa per caricare 2 µ l di standard e campioni nei pozzetti. Evitare di utilizzare le corsie più esterne, che tendono a correre campioni poco. Montare la camera superiore dell’apparato gel-esecuzione e inserire il gel in un serbatoio in esecuzione raffreddato (~ 10 ° C) (° C 10) contenente 1 x ritmo tampone. Riempire la camera superiore con buffer di ritmo di 1 x. Accendere il potere ed eseguire il gel a 200 V (costante V) per 30 minuti e quindi aumento di tensione fino a 1000 V per 1h 40 min. Proteggere il gel dalla luce (ad esempio, eseguendo il wrapping serbatoi in sacchi neri della spazzatura). Nota: Controllare i gel ~ 5 min dopo aver acceso la tensione e poi un altro 5 minuti dopo l’aumento della tensione fino a 1000 V. Se l’alimentatore è in grado di mantenere la tensione, poi c’è probabilmente un problema di buffer. Rimuovere il gel dal serbatoio. Rimontare l’alloggiamento superiore, verificare attentamente il posizionamento di tutte le guarnizioni. Un grande chip sul bordo superiore della lastra di vetro può impedire la piastra formando una buona tenuta con la guarnizione. Questo di solito può essere temporaneamente risolto aggiungendo una goccia di agarosio fuso 5% (p/v) per la parte scheggiata del vetro, prima di aggiungere l’alloggiamento superiore. 9. Visualizzazione di un gel di ritmo Nota: utilizzare un gel dotato di lungo-fluttuano UV bulbi nel transilluminatore e un filtro di emissione per la fotocamera che è adatto per il fluoroforo, qui 530 nm sistema di imaging. In alternativa, uno scanner laser può essere utilizzato anche, come descritto in Goubet 2. Garantire il gel sistema di imaging è privo di polvere pulendo con tessuto umido privo di lanugine. Rimuovere il gel nel serbatoio di ritmo e mostra brevemente mentre il gel è ancora nelle lastre di vetro (< 80 ms) per determinare se la parte anteriore della tintura è ancora sul gel. Aprire il gel utilizzando uno strumento di Cuneo e mentre il gel è ancora su un vetro piatto, utilizzare una taglierina della pizza per rimuovere sia il gel d’impilamento e, se la parte anteriore della tintura è ancora sul gel, il fondo del gel. Mettere ~ 5 mL H 2 O sulla superficie del transilluminatore e quindi trasferire il gel direttamente sul transilluminatore. Impostare il filtro UV 605 e accendere il transilluminatore UV longwave (Vedi Tabella materiali) utilizzando il software. Nota: Il fluoroforo formiche qui utilizzato ha un’eccitazione/emissione di 353/520 nm. Prendere diverse immagini a diversi tempi di esposizione (per esempio, 100 ms a 10 s). Accertarsi che la luce UV è spento tra le immagini cliccando sul pulsante di luce UV (per disattivarlo) per evitare di degradare la fluorescenza. Non garantire che almeno 2 delle immagini bande saturi (il software di imaging di gel lo indicherà). Salva file come immagini ad alta-resolution.tif. Nota: Immagini possono essere analizzati utilizzando il software fornito con il gel sistema di imaging, o utilizzando software di analisi di immagine liberamente disponibili, come ad esempio ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/). Vedere la sezione di risultati per una discussione di quantificazione.