Genom çapında transkript çürüme oranları Proliferasyona ve durgun insan fibroblast belirleme
Summary
Transkript çürüme oranları izleme ve differentially çürüyen genlerin belirlenmesi için bir protokolü üreten Proliferasyona ve durgun birincil insan dermal fibroblastlar, açıklayın.
Abstract
Sendika hangi hücreleri hücre bölünmesi kesildiği tarih var, ancak kapasitesi çoğalırlar korumak tersine çevrilebilir, geçici bir durumdur. Bizimki de dahil olmak üzere birden fazla çalışmalar sendika gen ekspresyonu yaygın değişiklikler ile ilişkili olduğunu göstermiştir. Bu değişikliklerin bazıları düzeyi veya etkinlik E2F ve MYC gibi nükleer silahların yayılmasına karşı ilişkili transkripsiyon faktörlerin değişiklikleri yoluyla ortaya çıkar. MRNA decay gen ekspresyonu Proliferasyona ve durgun hücreler arasında değişimler de katkıda bulunabilir göstermiştir. Bu protokol için insan dermal sünnet fibroblastlar Proliferasyona ve durgun kültürleri oluşturma yordamı açıklanmaktadır. O zaman Actinomycin D (ActD) ile Proliferasyona ve durgun hücrelerdeki yeni transkripsiyonu inhibe için yordamlar açıklar. ActD tedavi transkript çürüme yeni transkripsiyon dissociating için basit ve tekrarlanabilir bir yaklaşım temsil eder. Bir ActD tedavi ActD hücre canlılığı etkilediğinden zamanlı Kurs için bir kısa zaman dilimi sınırlı olmalıdır dezavantajdır. Transkript düzeyleri transkript çürüme hızı için zaman içinde izlenir. Bu yordam, genler ve karşı sakin fibroblastlar Proliferasyona içinde fark çürüme sergi izoformlarının tanımlanması için verir.
Introduction
Transkript düzeyde kararlı duruma katkı transkript sentezi ve transkript çürüme yansıtır. Düzenlenmiş ve koordine transkript çürüme biyolojik süreçlerin1,2,3,4kontrol etmek için önemli bir mekanizmadır. Örneğin, transkript çürüme oranları etkinleştirme aşağıdaki olaylar zamansal serisi için katkıda bulunmak için inflamatuar sitokin tümör nekrozis faktör5tarafından gösterilmiştir.
Biz daha önce yayılması ve birincil insan fibroblast sendika arasında geçiş değişiklikleri birçok genler6transkript düzeyleri ile ilişkili olduğunu göstermiştir. Bu değişikliklerin bazıları bu iki devlet arasında transkripsiyon faktörleri Faaliyet farklılıkları yansıtmaktadır.
Transkript’ın çürüme oranı değişiklikleri de değişiklikleri bir transkript iki farklı devletler7,8ifade düzeyde katkıda bulunabilir. Yayılması ve sendika arasında geçiş değişiklikleri birden çok mikroRNA’lar9düzeyleri ile ilişkili olduğunu bizim önceki bulgular dayanarak, biz de değişiklikleri fark transkript çürümesi bir katkı olup sordu karşı sakin fibroblastlar Proliferasyona içinde gen ekspresyonu.
Transkript istikrar izlemek için transkript genom genelinde karşı sakin hücreleri Proliferasyona çürüme oranı belirlenir. Bunu başarmak için yeni transkripsiyon bir inhibitörü tanıtımı ve hangi zaman içinde bireysel transkript kayboldu oranı izleme karşı sakin fibroblastlar Proliferasyona içinde çürüme oranları izlenir. Bu yaklaşımın avantajı yeni transkript sentezini inhibe tarafından genel gen ekspresyonu, sade bir şekilde izlemek yöntemleri ile karşılaştırıldığında, biz bu Tutanaklar ayrı ayrı hangi onlar are kurundan çürüme oranı belirlemek mümkün olmasını, olur transkripsiyonu.
ActD tedavi yeni transkripsiyonu inhibe ve transkript çürüme hızı birden çok önceki çalışmalarda başarıyla uygulandı. ActD pro-inflamatuar sitokinlerin5ile tedavi sonucu transkript bolca RNA istikrar değişiklikleri önemini incelemek için kullanılmıştır. Benzer bir yaklaşım da farklı kas fenotip10evlat edinmek gibi farklılaştırılmış C2C12 hücreleri karşı Proliferasyona transkript çürüme oranı farklılıkları incelemek için kullanılmıştır. Başka bir örnek olarak, küresel mRNA yarı-hayat da pluripotent tespit edildi ve11farklı fare embriyonik kök hücreleri. Bu örneklerde, mRNA decay transkript bereket düzenleyen ve farklı hücre Birleşik hücrelere geçiş için önemli olduğu gösterilmiştir.
Aşağıda açıklanan yöntemleri uygulayarak, biz fibroblastlar Proliferasyona ve durgun Birleşik12karşılaştırırken transkript çürüme oranları yaklaşık 500 genlerdeki değişikliklerin keşfetti. Özellikle, keşfettiğimiz hücreler sendika için geçiş ne zaman downregulated deneniyor hücrelerdeki olduğunu, mikroRNA miR-29hedeflerini stabilize. Biz burada Proliferasyona ve durgun hücrelerdeki çürüme oranları belirlemek için kullanılan yöntemleri açıklar. Bu yöntemi hızla çürüyen genler hakkında bilgi aranan zaman küresel mRNA decay oranları iki ayrı benzer koşullar içinde karşılaştırmak için yararlıdır. İki boyutlu üç boyutlu kültürler içinde hücre kültür koşulların transkript çürüme, örneğin, üzerinde etkisi gibi diğer soruları gidermek de kullanılabilir. Çürüme oranları microarrays veya RNA-Seq. alternatif olarak, gerçek zamanlı qPCR gibi yöntemler ile kararlı genom çapında olabilir veya Kuzey kurutma çürüme oranları gen gen veya izoformu izoformu olarak belirlemek için kullanılabilir. Bu oranları daha sonra izlenen her gen half-life hesaplamak ve iki koşullarında farklı çürüme oranları ile genlerin tanımlamak için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sendika mitogens veya serum geri çekilmesi, hücre adezyon ve iletişim inhibisyon eksikliği de dahil olmak üzere dış sinyalleri tarafından indüklenen. Temas inhibisyonu, sendika, inducing için birden fazla olası yönteminden birini hücreleri hücre hücre kişiye yanıt proliferatif Hücre döngüsünde çıkmak çok örümceklerle korunmuş bir süreçtir. Temas inhibisyonu sendika ikna etmek için bir yöntem örneği olarak üzerinde odaklanabilir. Önceki çalışmalarda hücre-hücre iletişim mikroRNA Bi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
HAC Milton E. Cassel bilgin Rita Allen Vakfı (http://www.ritaallenfoundation.org) yapıldı. Bu eser mükemmellik hibe P50 GM071508 Ulusal Enstitüsü genel Tıp Bilimleri Merkezi’nden HAC (Özel Dedektif David Botstein), ilaç Vakfı Hibe 2007RSGl9572, Ulusal Bilim Vakfı Hibe OCI-1047879 David Ağustos hibe tarafından finanse edildi, Ulusal Enstitüsü genel Tıp Bilimleri R01 GM081686, Ulusal Enstitüsü genel Tıp Bilimleri R01 GM0866465, Eli & Edythe geniş merkezi rejeneratif tıp & kök hücre araştırmaları, Iris Cantor kadın Sağlık Merkezi/UCLA CTSI NIH Grant UL1TR000124 ve lösemi Lenfoma Derneği. Bu yayında bildirilen Araştırma Ulusal Sağlık Enstitüleri Ödülü numarası P50CA092131 altında Ulusal Kanser Enstitüsü tarafından desteklenmiştir. Fon çalışma tasarım, veri toplama ve analizi, yayımlamaya karar veya el yazması hazırlanması herhangi bir rolü yoktu. HAC Eli bir üyesidir & Edythe rejeneratif tıp geniş merkezi & kök hücre araştırmaları, UCLA moleküler biyoloji Enstitüsü ve UCLA Biyoinformatik bölümler arası programı.
Materials
| Centrifuges for microcentrifuge tubes capable of reaching 12,000 x g and 4°C | |||
| Equipment for running agarose gels | |||
| Sterile tissue culture plates and conical tubes | |||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11965-118 | |
| Fetal bovine serum | VWR | 35-010-CV | |
| Sterile serological pipets, pipettors and pipet tips for tissue culture | |||
| Individually wrapped, disposable Rnase-free pipettes, pipette tips and tubes for RNA isolation and analysis | |||
| Disposable gloves to be worn when handling reagents and RNA samples | |||
| RNaseZap | Invitrogen | AM9780 | For decontaminating work surfaces from RNase |
| 2.0 ml eppendorf tubes | |||
| Trypsin-EDTA Solution 10X | Millipore Sigma | 9002-07-07 | |
| Sterile PBS | Life Technologies | 14190-250 | |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Actinomycin D | Millipore Sigma | A1410-2 mg | inhibits transcription |
| Sterile DMSO | Fisher Scientific | 31-761-00ML | solvent for actinomycin D |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | ICN19400225 | MP Biomedicals, Inc product |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618500 | molecular biology grade |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP28184 | molecular biology grade |
| RNase-free Glycogen (20 mg/ml aqueous solution) | Thermo Fisher Scientific | R0551 | carrier for RNA precipitation |
| TURBO DNA-free Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1907 | removes DNA with DNase, then, in a subsequent step, inactivates DNA and removes divalent cations |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific | ICN820721 | MP Biomedicals, Inc product |
| Loading dye for RNA gel | Thermo Fisher Scientific | R0641 | suitable even for denaturing electrophoresis |
| Millenium RNA markers | Thermo Fisher Scientific | AM7150 | RNA ladder |
| One-color RNA Spike-in Kit | Agilent Technology | 5188-5282 | Example spike-in control for Agient microarray analysis |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | molecular biology grade, for TAE buffer |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38-500 | for TAE buffer |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | electrophoresis grade, for gels |
| Ethidium bromide | Millipore Sigma | E7637 | for molecular biology |
| External RNA Controls Consortium RNA Spike-in Mix | Thermo Fisher Scientific | 4456740 | Spike-in control for RNA Seq |
| TruSeq Stranded mRNA Library Preparation Kit A (48 samples, 12 indexes) | Illumina | RS-122-2101 | for RNA Seq |
| 96-well 0.3 ml PCR plate | Thermo Fisher Scientific | AB-0600 | for real-time qPCR |
| Microseal B adhesive seals | Bio-Rad | MSB1001 | for real-time qPCR |
| Rnase/Dnase-free Reagent Reservoirs | VWR | 89094-662 | for real-time qPCR |
| Rnase/Dnase-free Eight tube strips and caps | Thermo Fisher Scientific | AM12230 | for real-time qPCR |
| SuperScript Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18090010 | for real-time qPCR |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63880 | for real-time qPCR |
References
- Neff, A. T., Lee, J. Y., Wilusz, J., Tian, B., Wilusz, C. J. Global analysis reveals multiple pathways for unique regulation of mRNA decay in induced pluripotent stem cells. Genome Res. 22 (8), 1457-1467 (2012).
- Raghavan, A., Ogilvie, R. L., Reilly, C., Abelson, M. L., Raghavan, S., Vasdewani, J., Krathwohl, M., Bohjanen, P. R. Genome-wide analysis of mRNA decay in resting and activated primary human T lymphocytes. Nucleic Acids Res. 30 (24), 5529-5538 (2002).
- Cheadle, C., Fan, J., Cho-Chung, Y. S., Werner, T., Ray, J., Do, L., Gorospe, M., Becker, K. G. Control of gene expression during T cell activation: alternate regulation of mRNA transcription and mRNA stability. BMC Genomics. 6, 75 (2005).
- Yang, E., van Nimwegen, E., Zavolan, M., Rajewsky, N., Schroeder, M., Magnasco, M., Darnell, J. E. Decay rates of human mRNAs: correlation with functional characteristics and sequence attributes. Genome Res. 13 (8), 1863-1872 (2003).
- Hao, S., Baltimore, D. The stability of mRNA influences the temporal order of the induction of genes encoding inflammatory molecules. Nat Immunol. 10 (3), 281-288 (2009).
- Coller, H. A., Sang, L., Roberts, J. M. A new description of cellular quiescence. PLoS Biol. 4 (3), 83 (2006).
- Wilusz, C. J., Wormington, M., Peltz, S. W. The cap-to-tail guide to mRNA turnover. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (4), 237-246 (2001).
- Garneau, N. L., Wilusz, J., Wilusz, C. J. The highways and byways of mRNA decay. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (2), 113-126 (2007).
- Suh, E. J., Remillard, M. Y., Legesse-Miller, A., Johnson, E. L., Lemons, J. M., Chapman, T. R., Forman, J. J., Kojima, M., Silberman, E. S., Coller, H. A. A microRNA network regulates proliferative timing and extracellular matrix synthesis during cellular quiescence in fibroblasts. Genome Biol. 13 (12), 121 (2012).
- Hoen, P. A., Hirsch, M., de Meijer, E. J., de Menezes, R. X., van Ommen, G. J., den Dunnen, J. T. mRNA degradation controls differentiation state-dependent differences in transcript and splice variant abundance. Nucleic Acids Res. 39 (2), 556-566 (2011).
- Sharova, L. V., Sharov, A. A., Nedorezov, T., Piao, Y., Shaik, N., Ko, M. S. Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells. DNA Res. 16 (1), 45-58 (2009).
- Johnson, E. L., Robinson, D. G., Coller, H. A. Widespread changes in mRNA stability contribute to quiescence-specific gene expression patterns in a fibroblast model of quiescence. BMC Genomics. 18 (1), 123 (2017).
- Legesse-Miller, A., Elemento, O., Pfau, S. J., Forman, J. J., Tavazoie, S., Coller, H. A. let-7 Overexpression leads to an increased fraction of cells in G2/M, direct down-regulation of Cdc34, and stabilization of Wee1 kinase in primary fibroblasts. J Biol Chem. 284 (11), 6605-6609 (2009).
- Jiang, L., Schlesinger, F., Davis, C. A., Zhang, Y., Li, R., Salit, M., Gingeras, T. R., Oliver, B. Synthetic spike-in standards for RNA-seq experiments. Genome Res. 21 (9), 1543-1551 (2011).
- Tan, P. K., Downey, T. J., Spitznagel, E. L., Xu, P., Fu, D., Dimitrov, D. S., Lempicki, R. A., Raaka, B. M., Cam, M. C. Evaluation of gene expression measurements from commercial microarray platforms. Nucleic Acids Res. 31 (19), 5676-5684 (2003).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Wong, M. L., Medrano, J. F. Real-time PCR for mRNA quantitation. Biotechniques. 39 (1), 75-85 (2005).
- Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nat Protoc. 4 (1), 37-43 (2009).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Anders, S., Reyes, A., Huber, W. Detecting differential usage of exons from RNA-seq data. Genome Res. 22 (10), 2008-2017 (2012).
- Vandenbroucke, I. I., Vandesompele, J., Paepe, A. D., Messiaen, L. Quantification of splice variants using real-time PCR. Nucleic Acids Res. 29 (13), 68-68 (2001).
- Hargrove, J. L., Hulsey, M. G., Beale, E. G. The kinetics of mammalian gene expression. Bioessays. 13 (12), 667-674 (1991).
- Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. Journal of the Royal Statistical Society Series B. 57, 289-300 (1995).
- Hwang, H. W., Wentzel, E. A., Mendell, J. T. Cell-cell contact globally activates microRNA biogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (17), 7016-7021 (2009).
- Friedel, C. C., Dolken, L., Ruzsics, Z., Koszinowski, U. H., Zimmer, R. Conserved principles of mammalian transcriptional regulation revealed by RNA half-life. Nucleic Acids Res. 37 (17), 115 (2009).
- Soeiro, R., Amos, H. mRNA half-life measured by use of actinomycin D in animal cells – A caution. Biochimica et Biophysica Acta. 129 (2), 406-409 (1966).
- Perez-Ortin, J. E., Alepuz, P., Chavez, S., Choder, M. Eukaryotic mRNA decay: methodologies, pathways, and links to other stages of gene expression. J Mol Biol. 425 (20), 3750-3775 (2013).
- Chen, C. Y., Ezzeddine, N., Shyu, A. B. Messenger RNA half-life measurements in mammalian cells. Methods Enzymol. 448, 335-357 (2008).
- Gupta, I., Clauder-Munster, S., Klaus, B., Jarvelin, A. I., Aiyar, R. S., Benes, V., Wilkening, S., Huber, W., Pelechano, V., Steinmetz, L. M. Alternative polyadenylation diversifies post-transcriptional regulation by selective RNA-protein interactions. Mol Syst Biol. 10, 719 (2014).
- Geisberg, J. V., Moqtaderi, Z., Fan, X., Ozsolak, F., Struhl, K. Global analysis of mRNA isoform half-lives reveals stabilizing and destabilizing elements in yeast. Cell. 156 (4), 812-824 (2014).
- Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes. Mol Cell. 31 (6), 925-932 (2008).
- Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay. Nat Biotechnol. 23 (2), 232-237 (2005).
- Rabani, M., Levin, J. Z., Fan, L., Adiconis, X., Raychowdhury, R., Garber, M., Gnirke, A., Nusbaum, C., Hacohen, N., Friedman, N., et al. Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells. Nat Biotechnol. 29 (5), 436-442 (2011).
- Marzi, M. J., Ghini, F., Cerruti, B., de Pretis, S., Bonetti, P., Giacomelli, C., Gorski, M. M., Kress, T., Pelizzola, M., Muller, H., et al. Degradation dynamics of microRNAs revealed by a novel pulse-chase approach. Genome Res. 26 (4), 554-565 (2016).
