Определение генома всей стенограммы распада ставок в пролиферирующих и покоя фибробластов
Summary
Мы описываем протокол для генерации пролиферирующих и покоя первичного кожного фибробластов, мониторинга Стенограмма распада ставки и выявления дифференциально распадаясь генов.
Abstract
Покоя является временной, реверсивные государство, в котором клетки перестали клеточного деления, но сохранить способность размножаться. Несколько исследований, в том числе наша, продемонстрировали, что покоя связан с широко распространенные изменения в экспрессии генов. Некоторые из этих изменений происходят через изменения в уровень или деятельности, связанных с распространением транскрипционных факторов, таких как E2F и MYC. Мы показали, что разрушение мРНК может также способствовать изменения в экспрессии генов между покоя и пролиферирующих клеток. В этом протоколе мы описываем порядок установления пролиферирующих и покоя культуры фибробластов человека дермального плоть. Мы затем Опишите процедуры для ингибирования новой транскрипции в клетках пролиферирующих и покоя с актиномицин Д (АСРТ). АСРТ лечения представляет собой простой и воспроизводимый подход к отделения новой транскрипции от гниения транскрипт. Недостатком АСРТ лечения является, что время курс должна быть ограничена короткого промежутка времени, потому что АСРТ влияет на жизнеспособность клеток. Стенограмма уровни контролируются со временем для определения ставок Стенограмма распада. Эта процедура позволяет для идентификации генов и изоформ, проявлять дифференцированный распада в пролиферирующих против покоя фибробластов.
Introduction
Стационарном уровнях стенограмм отражают вклад Стенограмма синтеза и распада Стенограмма. Регулируемые и скоординированных Стенограмма кариеса является важным механизмом для контроля биологических процессов1,2,3,4. К примеру Стенограмма распада ставки было показано вносить временные серии событий после активации воспалительных цитокинов фактор некроза опухоли5.
Ранее мы показали, что переход между распространением и покоя в первичной фибробластов связан с изменениями в уровнях Стенограмма многих генов6. Некоторые из этих изменений отражают различия в деятельности факторов транскрипции между этими двумя государствами.
Изменения в скорость распада стенограмма может также способствовать изменениям уровня выражения стенограммы в двух разных государствах7,8. Основываясь на наших предыдущих выводах, что переход между распространением и покоя связан с изменениями в уровнях несколько микроРНК9, мы спросили, есть ли также взнос от дифференциального Стенограмма распада в изменения в Экспрессия генов в пролиферирующих против покоя фибробластов.
Для того чтобы контролировать Стенограмма стабильности, мы определили скорость распада стенограммы генома общесистемной в пролиферирующих против покоя клетки. Для достижения этой цели, мы наблюдение распада ставки в пролиферирующих против покоя фибробластов, представляя ингибитор новой транскрипции и мониторинг частоты, на которой отдельные стенограммы исчез со временем. Преимуществом этого подхода является, что, по сравнению с методами, которые просто контролировать общий экспрессии генов, путем ингибирования синтеза новых стенограммы, мы сможем определить скорость распада для этих стенограмм отдельно от скорость, на которой они должны переписана.
Лечение АСРТ подавляют новой транскрипции и определить показатели распада Стенограмма успешно применялся в нескольких предыдущих исследований. АСРТ был использован для рассекать важность стабильности РНК в изменения в изобилии стенограмма, что результат от лечения с5провоспалительных цитокинов. Аналогичный подход используется также вскрыть различия в Стенограмма скорость распада в пролиферирующих против дифференцированных клеток C2C12, как они принимают дифференцированных мышечных фенотип10. В качестве другого примера глобальные полувыведения mRNA также были обнаружены в плюрипотентных и дифференцированной мыши эмбриональные стволовые клетки11. В этих примерах иметь важное значение для регулирования Стенограмма изобилия и переход клеток различных клеточных государствам было показано разрушение мРНК.
Применение методов, описанных ниже, мы обнаружили изменения темпов Стенограмма распада в приблизительно 500 генов при сравнении фибробластов в пролиферирующих и покоя государств12. В частности мы обнаружили, что цели микроРНК miR-29, который downregulated в неработающем клеток, стабилизируются, когда клетки переход к покоя. Здесь мы описываем методология, которую мы использовали для определения ставок распада в клетках пролиферирующих и покоя. Эта методология является полезным для сравнения глобальные показатели распада мРНК в двух отдельных, но аналогичные условия, когда запрашивается информация о быстро распадаться генов. Он может также использоваться для решения другие такие вопросы, как влияние условий культуры клеток на стенограмму распада, например, в двух измерениях против трех мерного культур. Распад ставки могут быть определены геном широкий с методами например microarrays или РНК-след альтернативно, ПЦР в реальном времени или Северный blotting может использоваться для определения ставок распада на основе гена в геном или изоформы по изоформы. Эти ставки затем может использоваться для вычисления half-life каждого наблюдаемого гена и выявления генов с показателями распада, которые отличаются в двух условий.
Protocol
Representative Results
Discussion
Покоя может быть вызвана внешних сигналов, включая вывод митогены или сыворотки, отсутствие клеточной адгезии и ингибирование контакт. Ингибирование контакта, один из нескольких возможных методов для стимулирования покоя, является весьма эволюционно сохранены процесс, в котором клет…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
HAC был Милтон E. Cassel ученый Аллен фонда Рита (http://www.ritaallenfoundation.org). Эта работа финансировалась за счет грантов для HAC от национального института Генеральной медицинских наук центра передового опыта Грант Р50 GM071508 (David п.и. Ботштейн), Фонд PhRMA Грант 2007RSGl9572, национальной науки Фонд Грант OCI-1047879-Дэвид августа, Национальный институт Генеральной медицинских наук R01 GM081686, Национальный институт общих медицинских наук R01 GM0866465, Эли & Edythe широкой центр регенеративной медицины & исследования стволовых клеток, Iris Кантор женщин центр здоровья/UCLA CTSI низ Грант UL1TR000124 и лейкемии лимфомы общества. Исследования в этой публикации было поддержано национального института рака национальных институтов здоровья под награду номер P50CA092131. Спонсоры имел никакой роли в дизайн исследования, сбор данных и анализ, решение опубликовать или подготовка рукописи. ВАК является членом Eli & Edythe Широкое центр восстановительной медицины & исследования стволовых клеток, Институт молекулярной биологии Калифорнийского университета и UCLA биоинформатики межведомственной программы.
Materials
| Centrifuges for microcentrifuge tubes capable of reaching 12,000 x g and 4°C | |||
| Equipment for running agarose gels | |||
| Sterile tissue culture plates and conical tubes | |||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11965-118 | |
| Fetal bovine serum | VWR | 35-010-CV | |
| Sterile serological pipets, pipettors and pipet tips for tissue culture | |||
| Individually wrapped, disposable Rnase-free pipettes, pipette tips and tubes for RNA isolation and analysis | |||
| Disposable gloves to be worn when handling reagents and RNA samples | |||
| RNaseZap | Invitrogen | AM9780 | For decontaminating work surfaces from RNase |
| 2.0 ml eppendorf tubes | |||
| Trypsin-EDTA Solution 10X | Millipore Sigma | 9002-07-07 | |
| Sterile PBS | Life Technologies | 14190-250 | |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Actinomycin D | Millipore Sigma | A1410-2 mg | inhibits transcription |
| Sterile DMSO | Fisher Scientific | 31-761-00ML | solvent for actinomycin D |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | ICN19400225 | MP Biomedicals, Inc product |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618500 | molecular biology grade |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP28184 | molecular biology grade |
| RNase-free Glycogen (20 mg/ml aqueous solution) | Thermo Fisher Scientific | R0551 | carrier for RNA precipitation |
| TURBO DNA-free Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1907 | removes DNA with DNase, then, in a subsequent step, inactivates DNA and removes divalent cations |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific | ICN820721 | MP Biomedicals, Inc product |
| Loading dye for RNA gel | Thermo Fisher Scientific | R0641 | suitable even for denaturing electrophoresis |
| Millenium RNA markers | Thermo Fisher Scientific | AM7150 | RNA ladder |
| One-color RNA Spike-in Kit | Agilent Technology | 5188-5282 | Example spike-in control for Agient microarray analysis |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | molecular biology grade, for TAE buffer |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38-500 | for TAE buffer |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | electrophoresis grade, for gels |
| Ethidium bromide | Millipore Sigma | E7637 | for molecular biology |
| External RNA Controls Consortium RNA Spike-in Mix | Thermo Fisher Scientific | 4456740 | Spike-in control for RNA Seq |
| TruSeq Stranded mRNA Library Preparation Kit A (48 samples, 12 indexes) | Illumina | RS-122-2101 | for RNA Seq |
| 96-well 0.3 ml PCR plate | Thermo Fisher Scientific | AB-0600 | for real-time qPCR |
| Microseal B adhesive seals | Bio-Rad | MSB1001 | for real-time qPCR |
| Rnase/Dnase-free Reagent Reservoirs | VWR | 89094-662 | for real-time qPCR |
| Rnase/Dnase-free Eight tube strips and caps | Thermo Fisher Scientific | AM12230 | for real-time qPCR |
| SuperScript Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18090010 | for real-time qPCR |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63880 | for real-time qPCR |
References
- Neff, A. T., Lee, J. Y., Wilusz, J., Tian, B., Wilusz, C. J. Global analysis reveals multiple pathways for unique regulation of mRNA decay in induced pluripotent stem cells. Genome Res. 22 (8), 1457-1467 (2012).
- Raghavan, A., Ogilvie, R. L., Reilly, C., Abelson, M. L., Raghavan, S., Vasdewani, J., Krathwohl, M., Bohjanen, P. R. Genome-wide analysis of mRNA decay in resting and activated primary human T lymphocytes. Nucleic Acids Res. 30 (24), 5529-5538 (2002).
- Cheadle, C., Fan, J., Cho-Chung, Y. S., Werner, T., Ray, J., Do, L., Gorospe, M., Becker, K. G. Control of gene expression during T cell activation: alternate regulation of mRNA transcription and mRNA stability. BMC Genomics. 6, 75 (2005).
- Yang, E., van Nimwegen, E., Zavolan, M., Rajewsky, N., Schroeder, M., Magnasco, M., Darnell, J. E. Decay rates of human mRNAs: correlation with functional characteristics and sequence attributes. Genome Res. 13 (8), 1863-1872 (2003).
- Hao, S., Baltimore, D. The stability of mRNA influences the temporal order of the induction of genes encoding inflammatory molecules. Nat Immunol. 10 (3), 281-288 (2009).
- Coller, H. A., Sang, L., Roberts, J. M. A new description of cellular quiescence. PLoS Biol. 4 (3), 83 (2006).
- Wilusz, C. J., Wormington, M., Peltz, S. W. The cap-to-tail guide to mRNA turnover. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (4), 237-246 (2001).
- Garneau, N. L., Wilusz, J., Wilusz, C. J. The highways and byways of mRNA decay. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (2), 113-126 (2007).
- Suh, E. J., Remillard, M. Y., Legesse-Miller, A., Johnson, E. L., Lemons, J. M., Chapman, T. R., Forman, J. J., Kojima, M., Silberman, E. S., Coller, H. A. A microRNA network regulates proliferative timing and extracellular matrix synthesis during cellular quiescence in fibroblasts. Genome Biol. 13 (12), 121 (2012).
- Hoen, P. A., Hirsch, M., de Meijer, E. J., de Menezes, R. X., van Ommen, G. J., den Dunnen, J. T. mRNA degradation controls differentiation state-dependent differences in transcript and splice variant abundance. Nucleic Acids Res. 39 (2), 556-566 (2011).
- Sharova, L. V., Sharov, A. A., Nedorezov, T., Piao, Y., Shaik, N., Ko, M. S. Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells. DNA Res. 16 (1), 45-58 (2009).
- Johnson, E. L., Robinson, D. G., Coller, H. A. Widespread changes in mRNA stability contribute to quiescence-specific gene expression patterns in a fibroblast model of quiescence. BMC Genomics. 18 (1), 123 (2017).
- Legesse-Miller, A., Elemento, O., Pfau, S. J., Forman, J. J., Tavazoie, S., Coller, H. A. let-7 Overexpression leads to an increased fraction of cells in G2/M, direct down-regulation of Cdc34, and stabilization of Wee1 kinase in primary fibroblasts. J Biol Chem. 284 (11), 6605-6609 (2009).
- Jiang, L., Schlesinger, F., Davis, C. A., Zhang, Y., Li, R., Salit, M., Gingeras, T. R., Oliver, B. Synthetic spike-in standards for RNA-seq experiments. Genome Res. 21 (9), 1543-1551 (2011).
- Tan, P. K., Downey, T. J., Spitznagel, E. L., Xu, P., Fu, D., Dimitrov, D. S., Lempicki, R. A., Raaka, B. M., Cam, M. C. Evaluation of gene expression measurements from commercial microarray platforms. Nucleic Acids Res. 31 (19), 5676-5684 (2003).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Wong, M. L., Medrano, J. F. Real-time PCR for mRNA quantitation. Biotechniques. 39 (1), 75-85 (2005).
- Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nat Protoc. 4 (1), 37-43 (2009).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Anders, S., Reyes, A., Huber, W. Detecting differential usage of exons from RNA-seq data. Genome Res. 22 (10), 2008-2017 (2012).
- Vandenbroucke, I. I., Vandesompele, J., Paepe, A. D., Messiaen, L. Quantification of splice variants using real-time PCR. Nucleic Acids Res. 29 (13), 68-68 (2001).
- Hargrove, J. L., Hulsey, M. G., Beale, E. G. The kinetics of mammalian gene expression. Bioessays. 13 (12), 667-674 (1991).
- Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. Journal of the Royal Statistical Society Series B. 57, 289-300 (1995).
- Hwang, H. W., Wentzel, E. A., Mendell, J. T. Cell-cell contact globally activates microRNA biogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (17), 7016-7021 (2009).
- Friedel, C. C., Dolken, L., Ruzsics, Z., Koszinowski, U. H., Zimmer, R. Conserved principles of mammalian transcriptional regulation revealed by RNA half-life. Nucleic Acids Res. 37 (17), 115 (2009).
- Soeiro, R., Amos, H. mRNA half-life measured by use of actinomycin D in animal cells – A caution. Biochimica et Biophysica Acta. 129 (2), 406-409 (1966).
- Perez-Ortin, J. E., Alepuz, P., Chavez, S., Choder, M. Eukaryotic mRNA decay: methodologies, pathways, and links to other stages of gene expression. J Mol Biol. 425 (20), 3750-3775 (2013).
- Chen, C. Y., Ezzeddine, N., Shyu, A. B. Messenger RNA half-life measurements in mammalian cells. Methods Enzymol. 448, 335-357 (2008).
- Gupta, I., Clauder-Munster, S., Klaus, B., Jarvelin, A. I., Aiyar, R. S., Benes, V., Wilkening, S., Huber, W., Pelechano, V., Steinmetz, L. M. Alternative polyadenylation diversifies post-transcriptional regulation by selective RNA-protein interactions. Mol Syst Biol. 10, 719 (2014).
- Geisberg, J. V., Moqtaderi, Z., Fan, X., Ozsolak, F., Struhl, K. Global analysis of mRNA isoform half-lives reveals stabilizing and destabilizing elements in yeast. Cell. 156 (4), 812-824 (2014).
- Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes. Mol Cell. 31 (6), 925-932 (2008).
- Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay. Nat Biotechnol. 23 (2), 232-237 (2005).
- Rabani, M., Levin, J. Z., Fan, L., Adiconis, X., Raychowdhury, R., Garber, M., Gnirke, A., Nusbaum, C., Hacohen, N., Friedman, N., et al. Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells. Nat Biotechnol. 29 (5), 436-442 (2011).
- Marzi, M. J., Ghini, F., Cerruti, B., de Pretis, S., Bonetti, P., Giacomelli, C., Gorski, M. M., Kress, T., Pelizzola, M., Muller, H., et al. Degradation dynamics of microRNAs revealed by a novel pulse-chase approach. Genome Res. 26 (4), 554-565 (2016).
