Determinazione dei tassi di decadimento di trascrizione del genoma in fibroblasti umani proliferanti e quiescenti
Summary
Descriviamo un protocollo per la generazione di proliferazione e fibroblasti cutanei umani primari quiescenti, monitoraggio tassi di decadimento di trascrizione e l’individuazione di geni differenzialmente decadente.
Abstract
Quiescenza è uno stato temporaneo, reversibile, in cui le cellule hanno cessato la divisione cellulare, ma conservano la capacità di proliferare. Gli studi multipli, compreso il nostro, hanno dimostrato che la quiescenza è associato con diffuse cambiamenti nell’espressione genica. Alcuni di questi cambiamenti si verificano attraverso i cambiamenti nel livello o attività di fattori di trascrizione associati a proliferazione, come E2F e MYC. Abbiamo dimostrato che la degradazione del mRNA può anche contribuire a cambiamenti nell’espressione genica tra cellule proliferanti e quiescenti. In questo protocollo, descriviamo la procedura per stabilire la proliferazione e quiescenti colture di fibroblasti cutanei umani del prepuzio. Descriviamo quindi le procedure per l’inibizione di nuova trascrizione nelle cellule proliferanti e quiescenti con actinomicina D (ActD). ActD trattamento rappresenta un approccio semplice e riproducibile per dissociare nuova trascrizione dal decadimento di trascrizione. Uno svantaggio di ActD trattamento è che il corso di tempo deve essere limitato a un breve lasso di tempo perché ActD colpisce la vitalità cellulare. Livelli della trascrizione sono monitorati nel tempo per determinare i tassi di decadimento di trascrizione. Questa procedura permette l’identificazione di geni e isoforme che presentano decadimento differenziale in proliferazione contro fibroblasti quiescenti.
Introduction
Livelli allo stato stazionario di trascrizioni riflettono il contributo di sintesi di trascrizione e di decadimento di trascrizione. Regolato e coordinato trascrizione decadimento è un importante meccanismo per il controllo dei processi biologici1,2,3,4. Ad esempio, tassi di decadimento di trascrizione hanno dimostrati di contribuire per la serie temporale di eventi che seguono l’attivazione dalla citochina infiammatoria fattore di necrosi tumorale5.
Precedentemente abbiamo indicato che la transizione tra proliferazione e quiescenza in fibroblasti umani primari è associata con i cambiamenti dei livelli di trascrizione di molti geni6. Alcuni di questi cambiamenti riflettono le differenze nell’attività dei fattori di trascrizione tra questi due Stati.
Cambiamenti nel tasso di decadimento di una trascrizione possono anche contribuire ai cambiamenti del livello di espressione di un trascritto in due diversi stati7,8. Basato sui nostri risultati precedenti che la transizione tra proliferazione e quiescenza è associata con i cambiamenti nei livelli di più microRNA9, abbiamo chiesto se c’è anche un contributo dal decadimento di differenziale trascrizione nei cambiamenti espressione genica in proliferazione contro fibroblasti quiescenti.
Al fine di monitorare la stabilità di trascrizione, abbiamo determinato il tasso di decadimento delle trascrizioni genoma in proliferazione contro cellule quiescenti. Per raggiungere questo obiettivo, abbiamo monitorato tassi di decadimento in proliferazione contro fibroblasti quiescenti introducendo un inibitore della trascrizione nuovo e monitoraggio della frequenza in cui singole trascrizioni scomparse nel tempo. Il vantaggio di questo approccio è che, rispetto ai metodi che consentono di monitorare semplicemente espressione genica globale, inibendo la sintesi di nuova trascrizione, saremo in grado di determinare il tasso di decadimento per queste trascrizioni separatamente dal prezzo al quale sono trascritti.
ActD trattamento per inibire la trascrizione di nuovo e determinare i tassi di decadimento di trascrizione è applicato con successo in molteplici studi precedenti. ActD è stato usato per sezionare l’importanza della stabilità di RNA nei cambiamenti in abbondanza di trascrizione che derivano dal trattamento con citochine pro-infiammatorie5. Un approccio simile è stato utilizzato anche per sezionare le differenze nel tasso di decadimento di trascrizione in proliferazione contro cellule C2C12 differenziate come essi adottano un muscolo differenziato fenotipo10. Come altro esempio, global mRNA emivite inoltre sono state rilevate in pluripotenti e cellule staminali embrionali del mouse differenziato11. In questi esempi, la degradazione del mRNA ha dimostrato di essere importante per la regolazione di abbondanza di trascrizione e per la transizione delle cellule agli Stati differenti delle cellule.
Applicare i metodi descritti di seguito, abbiamo scoperto le variazioni nei tassi di decadimento di trascrizione in circa 500 geni quando si confrontano i fibroblasti proliferanti e quiescenti stati12. In particolare, abbiamo scoperto che gli obiettivi del microRNA miR-29, che è downregulated in cellule quiescenti, sono stabilizzati quando le cellule di transizione di quiescenza. Qui descriviamo la metodologia che abbiamo usato per determinare i tassi di decadimento in cellule proliferanti e quiescenti. Questa metodologia è utile per confrontare i tassi di decadimento mRNA globali in due distinti ma simili condizioni quando sono cercati informazioni rapidamente decadente geni. Potrebbe essere utilizzato anche per affrontare altre questioni, quali l’effetto delle condizioni di coltura delle cellule sul decadimento di trascrizione, per esempio, in due dimensioni contro tre culture dimensionale. Tassi di decadimento possono essere determinato genoma con metodi come microarrays o RNA-seq. in alternativa, in tempo reale qPCR o Macchiarsi nordico può essere utilizzato per determinare i tassi di decadimento su base gene di gene o isoforma di isoforma. Queste tariffe quindi possono essere utilizzate per calcolare il tempo di dimezzamento di ciascun gene monitorato e per identificare geni con i tassi di decadimento che sono diversi in due condizioni.
Protocol
Representative Results
Discussion
Quiescenza può essere indotta da segnali esterni, tra cui il ritiro di mitogeni o del siero, la mancanza di adesione cellulare e l’inibizione del contatto. Inibizione da contatto, uno dei più possibili metodi per indurre la quiescenza, è un processo altamente evolutivamente conservato in cui cellule uscire il ciclo proliferativo cellulare in risposta al contatto della cellula–cellula. Qui ci concentriamo sulla inibizione da contatto come un esempio di un metodo per indurre la quiescenza. Gli studi precedenti hanno se…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
HAC fu lo studioso di Milton E. Cassel della Rita Allen Foundation (http://www.ritaallenfoundation.org). Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni per HAC dal National Institute of General Medical Sciences centro della sovvenzione di eccellenza GM071508 P50 (P.I. David Botstein), PhRMA Foundation grant 2007RSGl9572, National Science Foundation Grant OCI-1047879 ad agosto David, National Institute of General Medical Sciences R01 GM081686, Istituto nazionale di scienze mediche generali R01 GM0866465, Eli & Edythe Broad centro di medicina rigenerativa & ricerca sulle cellule staminali, centro salute/UCLA CTSI NIH delle donne Iris Cantor Grant UL1TR000124 e alla Leukemia Lymphoma Society. Ricerca riportata in questa pubblicazione è stata sostenuta dal National Cancer Institute del National Institutes of Health, sotto Premio numero P50CA092131. I finanziatori non avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, raccolta dati e analisi, decisione di pubblicare o preparazione del manoscritto. HAC è un membro della Eli & Edythe Broad centro di medicina rigenerativa & Stem Cell Research, l’Istituto di biologia molecolare di UCLA e il programma interdipartimentale di bioinformatica di UCLA.
Materials
| Centrifuges for microcentrifuge tubes capable of reaching 12,000 x g and 4°C | |||
| Equipment for running agarose gels | |||
| Sterile tissue culture plates and conical tubes | |||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11965-118 | |
| Fetal bovine serum | VWR | 35-010-CV | |
| Sterile serological pipets, pipettors and pipet tips for tissue culture | |||
| Individually wrapped, disposable Rnase-free pipettes, pipette tips and tubes for RNA isolation and analysis | |||
| Disposable gloves to be worn when handling reagents and RNA samples | |||
| RNaseZap | Invitrogen | AM9780 | For decontaminating work surfaces from RNase |
| 2.0 ml eppendorf tubes | |||
| Trypsin-EDTA Solution 10X | Millipore Sigma | 9002-07-07 | |
| Sterile PBS | Life Technologies | 14190-250 | |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Actinomycin D | Millipore Sigma | A1410-2 mg | inhibits transcription |
| Sterile DMSO | Fisher Scientific | 31-761-00ML | solvent for actinomycin D |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | ICN19400225 | MP Biomedicals, Inc product |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618500 | molecular biology grade |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP28184 | molecular biology grade |
| RNase-free Glycogen (20 mg/ml aqueous solution) | Thermo Fisher Scientific | R0551 | carrier for RNA precipitation |
| TURBO DNA-free Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1907 | removes DNA with DNase, then, in a subsequent step, inactivates DNA and removes divalent cations |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific | ICN820721 | MP Biomedicals, Inc product |
| Loading dye for RNA gel | Thermo Fisher Scientific | R0641 | suitable even for denaturing electrophoresis |
| Millenium RNA markers | Thermo Fisher Scientific | AM7150 | RNA ladder |
| One-color RNA Spike-in Kit | Agilent Technology | 5188-5282 | Example spike-in control for Agient microarray analysis |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | molecular biology grade, for TAE buffer |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38-500 | for TAE buffer |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | electrophoresis grade, for gels |
| Ethidium bromide | Millipore Sigma | E7637 | for molecular biology |
| External RNA Controls Consortium RNA Spike-in Mix | Thermo Fisher Scientific | 4456740 | Spike-in control for RNA Seq |
| TruSeq Stranded mRNA Library Preparation Kit A (48 samples, 12 indexes) | Illumina | RS-122-2101 | for RNA Seq |
| 96-well 0.3 ml PCR plate | Thermo Fisher Scientific | AB-0600 | for real-time qPCR |
| Microseal B adhesive seals | Bio-Rad | MSB1001 | for real-time qPCR |
| Rnase/Dnase-free Reagent Reservoirs | VWR | 89094-662 | for real-time qPCR |
| Rnase/Dnase-free Eight tube strips and caps | Thermo Fisher Scientific | AM12230 | for real-time qPCR |
| SuperScript Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18090010 | for real-time qPCR |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63880 | for real-time qPCR |
References
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