קביעת הגנום כולו התעתיק הניוון ב Fibroblasts האדם מתרבים ומגדלי השבתה הדרגתית
Summary
אנו מתארים פרוטוקול מתרבים ביצירת ו fibroblasts השבתה הדרגתית העיקרי עורי אנושי, ניטור התעתיק הניוון ולאחר זיהוי גנים רקובה באופן שונה.
Abstract
תרדמה הוא מצב זמני, הפיכה בה תאים חדלו חלוקת התא, אך לשמר את היכולת להתרבות. מחקרים רבים, כולל שלנו, הראו כי תרדמה קשורה נפוצה שינויים בביטוי הגנים. חלק משינויים אלה להתרחש דרך שינויים ברמה או פעילות של גורמי שעתוק התפשטות-הקשורים, כגון E2F ו- MYC. הראו כי ה-mRNA דעיכה יכול לתרום גם שינויים בביטוי הגנים בין תאים מתרבים ומגדלי השבתה הדרגתית. ב פרוטוקול זה, אנו מתארים הליך הקמת תרבויות מתרבים ומגדלי השבתה הדרגתית של העורלה עורי האנושי fibroblasts. לאחר מכן נתאר את נהלי עיכוב חדש שעתוק בתאים מתרבים ומגדלי השבתה הדרגתית עם ואקטינומיצין D (ActD). טיפול ActD מייצג גישה ישירה, לשחזור בריא שעתוק חדש מהשחתה תעתיק. חיסרון של טיפול ActD היא כי מסלול הזמן חייב להיות מוגבל למסגרת זמן קצר כי ActD משפיע על התא הכדאיות. התעתיק רמות מנוטרים לאורך זמן לקביעת תעתיק הניוון. הליך זה מאפשר הזיהוי של גנים איזופורמים כי התערוכה הריקבון הדיפרנציאלי ב מתרבים לעומת fibroblasts השבתה הדרגתית.
Introduction
רמות מצב יציב של הפרוטוקולים משקפים את התרומה של התעתיק סינתזה ודעיכה תעתיק. מוסדר והוא תעתיק מתואמת דעיכה מנגנון חשוב לשליטה תהליכים ביולוגיים1,2,3,4. לדוגמה, התעתיק הניוון הוכחו לתרום הסדרה הטמפורלי של אירועים בעקבות ההפעלה על-ידי הגידול נקרוזה מקדם ציטוקינים דלקתיים5.
אנחנו הראו בעבר כי המעבר בין התפשטות תרדמה בתוך ראשי fibroblasts האנושי קשורה לשינויים ברמות תעתיק של גנים רבים6. חלק משינויים אלה משקפים הבדלים בפעילות של גורמי שעתוק בין שתי מדינות אלה.
שינוי בקצב של תמליל רדיואקטיבית יכול לתרום גם שינויים ברמת הביטוי של תעתיק שני מצבים שונים7,8. בהתבסס על הממצאים שלנו מוקדם יותר כי המעבר בין התפשטות תרדמה קשורה לשינויים ברמות של מיקרו Rna מספר9, שאלנו יש גם תרומה מהשחתה התעתיק דיפרנציאלית משתנה ב ביטוי גנים ב מתרבים לעומת fibroblasts השבתה הדרגתית.
כדי לעקוב אחר תעתיק יציבות, קבענו שיעור הריקבון של הפרוטוקולים הגנום כולו ב מתרבים לעומת תאים השבתה הדרגתית. כדי להשיג זאת, אנחנו במעקב הניוון ב מתרבים לעומת fibroblasts השבתה הדרגתית על ידי היכרות עם מעכב של שעתוק חדשים וניטור קצב שבו תעתיקים בודדים נעלם עם הזמן. היתרון של גישה זו הוא, לעומת שיטות המפקחים פשוט ביטוי גנים הכוללת, על ידי עיכוב סינתזה חדשה התעתיק, נוכל לקבוע את קצב הדעיכה תחפש ברישומים אלה בנפרד מן הקצב שבו הם עיבד.
טיפול ActD לעכב שעתוק חדשים ולקבוע תעתיק הניוון יושם בהצלחה במחקרים קודמים מרובים. ActD שימש לנתח את חשיבות יציבות הרנ א משתנה בשפע התעתיק הנובעים הטיפול בעזרת ציטוקינים פרו-דלקתיים5. בגישה דומה שימש גם לנתח את ההבדלים התעתיק קצב הדעיכה ב מתרבים לעומת תאים C2C12 כפי הם מאמצים של פנוטיפ של שריר הבדיל10. כדוגמה נוספת, ה-mRNA מחצית החיים הכללית גם זוהתה pluripotent, תאי גזע עובריים בעכבר הבדיל11. בדוגמאות אלה, ריקבון mRNA הוכח להיות חשוב עבור ויסות התעתיק שפע, את המעבר של תאים תאים שונים הברית.
יישום השיטות המתוארות להלן, גילינו לשינויים התעתיק הניוון כ 500 גנים בהשוואת fibroblasts הברית מתרבים ומגדלי השבתה הדרגתית12. בפרט, גילינו כי המטרות של microRNA מיר-29, אשר downregulated בתאים השבתה הדרגתית, התייצבו כאשר תאי מעבר תרדמה. נתאר כאן את המתודולוגיה שהשתמשנו כדי לקבוע הניוון תאים מתרבים ומגדלי השבתה הדרגתית. מתודולוגיה זו שימושית לצורך השוואת הכללית הניוון mRNA בשני נושאים שונים אך דומים לתנאים כאשר מידע אודות במהירות מרקיבים גנים מתבקשת. זה יכול לשמש גם כדי לטפל שאלות אחרות כגון ההשפעה של התא תנאי התרבות על התעתיק ריקבון, למשל, לשניים מימד לעומת שלוש התרבויות תלת-ממדי. הניוון יכול להיות נחוש הגנום כולו עם שיטות כמו מיקרו-מערכים או RNA-תת סעיף. לחילופין, qPCR בזמן אמת או סופג הצפוני יכול לשמש כדי לקבוע את הניוון על בסיס ג’ין-מאת-גן או isoform-על ידי-isoform. המחירים הללו יכולים לשמש לאחר מכן כדי לחשב את זמן מחצית החיים של כל הגן בפיקוח וכדי לזהות גנים עם הניוון השונים של שני תנאים.
Protocol
Representative Results
Discussion
תרדמה יכולה להיגרם על ידי אותות חיצוניים כולל נסיגה של mitogens או סרום, חוסר הידבקות תאים, וניגוד קשר. סימן דיכוי, אחת השיטות אפשריות מרובים עבור גרימת תרדמה, הוא תהליך מאוד אבולוציונית שנשמרת שבו תאים יציאה מחזור התא proliferative בתגובה מגע לתא. אנו מתמקדים כאן סימן דיכוי כדוגמה שיטה לזירוז תרדמה. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
HAC היה המלומד במילטון אי קסל של קרן אלן ריטה (http://www.ritaallenfoundation.org). עבודה זו מומן על ידי מענקים HAC מן המרכז הלאומי הכללי לרפואה למדעי מענק הצטיינות P50 GM071508 (חוקר פרטי דוד בוטשטיין), 2007RSGl9572 גרנט חברת פארמה הקרן, הלאומית למדע קרן OCI גרנט-1047879 דוד לאוגוסט, המכון הלאומי של גנרל רפואי מדעי R01 GM081686, המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית R01 GM0866465, אלי & אידית במרכז רחבה של רפואה רגנרטיבית & מחקר בתאי גזע CTSI המרכז לבריאות/UCLA NIH של הנשים איריס חזן גרנט UL1TR000124, והחברה לוקמיה לימפומה. מחקר דיווח בפרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי לסרטן של מכוני הבריאות הלאומיים תחת פרס מספר P50CA092131. התורמים שחיים היה אין תפקיד תכנון המחקר, איסוף נתונים, ניתוח, ההחלטה לפרסם או אופן ההכנה של כתב היד. HAC הוא חבר אלי & אידית במרכז רחבה של רפואה רגנרטיבית & מחקר תאי גזע, המכון לביולוגיה מולקולרית באוניברסיטת UCLA, התוכנית באצירת לביואינפורמטיקה באוניברסיטת UCLA.
Materials
| Centrifuges for microcentrifuge tubes capable of reaching 12,000 x g and 4°C | |||
| Equipment for running agarose gels | |||
| Sterile tissue culture plates and conical tubes | |||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11965-118 | |
| Fetal bovine serum | VWR | 35-010-CV | |
| Sterile serological pipets, pipettors and pipet tips for tissue culture | |||
| Individually wrapped, disposable Rnase-free pipettes, pipette tips and tubes for RNA isolation and analysis | |||
| Disposable gloves to be worn when handling reagents and RNA samples | |||
| RNaseZap | Invitrogen | AM9780 | For decontaminating work surfaces from RNase |
| 2.0 ml eppendorf tubes | |||
| Trypsin-EDTA Solution 10X | Millipore Sigma | 9002-07-07 | |
| Sterile PBS | Life Technologies | 14190-250 | |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Actinomycin D | Millipore Sigma | A1410-2 mg | inhibits transcription |
| Sterile DMSO | Fisher Scientific | 31-761-00ML | solvent for actinomycin D |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | ICN19400225 | MP Biomedicals, Inc product |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618500 | molecular biology grade |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP28184 | molecular biology grade |
| RNase-free Glycogen (20 mg/ml aqueous solution) | Thermo Fisher Scientific | R0551 | carrier for RNA precipitation |
| TURBO DNA-free Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1907 | removes DNA with DNase, then, in a subsequent step, inactivates DNA and removes divalent cations |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific | ICN820721 | MP Biomedicals, Inc product |
| Loading dye for RNA gel | Thermo Fisher Scientific | R0641 | suitable even for denaturing electrophoresis |
| Millenium RNA markers | Thermo Fisher Scientific | AM7150 | RNA ladder |
| One-color RNA Spike-in Kit | Agilent Technology | 5188-5282 | Example spike-in control for Agient microarray analysis |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | molecular biology grade, for TAE buffer |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38-500 | for TAE buffer |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | electrophoresis grade, for gels |
| Ethidium bromide | Millipore Sigma | E7637 | for molecular biology |
| External RNA Controls Consortium RNA Spike-in Mix | Thermo Fisher Scientific | 4456740 | Spike-in control for RNA Seq |
| TruSeq Stranded mRNA Library Preparation Kit A (48 samples, 12 indexes) | Illumina | RS-122-2101 | for RNA Seq |
| 96-well 0.3 ml PCR plate | Thermo Fisher Scientific | AB-0600 | for real-time qPCR |
| Microseal B adhesive seals | Bio-Rad | MSB1001 | for real-time qPCR |
| Rnase/Dnase-free Reagent Reservoirs | VWR | 89094-662 | for real-time qPCR |
| Rnase/Dnase-free Eight tube strips and caps | Thermo Fisher Scientific | AM12230 | for real-time qPCR |
| SuperScript Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18090010 | for real-time qPCR |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63880 | for real-time qPCR |
References
- Neff, A. T., Lee, J. Y., Wilusz, J., Tian, B., Wilusz, C. J. Global analysis reveals multiple pathways for unique regulation of mRNA decay in induced pluripotent stem cells. Genome Res. 22 (8), 1457-1467 (2012).
- Raghavan, A., Ogilvie, R. L., Reilly, C., Abelson, M. L., Raghavan, S., Vasdewani, J., Krathwohl, M., Bohjanen, P. R. Genome-wide analysis of mRNA decay in resting and activated primary human T lymphocytes. Nucleic Acids Res. 30 (24), 5529-5538 (2002).
- Cheadle, C., Fan, J., Cho-Chung, Y. S., Werner, T., Ray, J., Do, L., Gorospe, M., Becker, K. G. Control of gene expression during T cell activation: alternate regulation of mRNA transcription and mRNA stability. BMC Genomics. 6, 75 (2005).
- Yang, E., van Nimwegen, E., Zavolan, M., Rajewsky, N., Schroeder, M., Magnasco, M., Darnell, J. E. Decay rates of human mRNAs: correlation with functional characteristics and sequence attributes. Genome Res. 13 (8), 1863-1872 (2003).
- Hao, S., Baltimore, D. The stability of mRNA influences the temporal order of the induction of genes encoding inflammatory molecules. Nat Immunol. 10 (3), 281-288 (2009).
- Coller, H. A., Sang, L., Roberts, J. M. A new description of cellular quiescence. PLoS Biol. 4 (3), 83 (2006).
- Wilusz, C. J., Wormington, M., Peltz, S. W. The cap-to-tail guide to mRNA turnover. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (4), 237-246 (2001).
- Garneau, N. L., Wilusz, J., Wilusz, C. J. The highways and byways of mRNA decay. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (2), 113-126 (2007).
- Suh, E. J., Remillard, M. Y., Legesse-Miller, A., Johnson, E. L., Lemons, J. M., Chapman, T. R., Forman, J. J., Kojima, M., Silberman, E. S., Coller, H. A. A microRNA network regulates proliferative timing and extracellular matrix synthesis during cellular quiescence in fibroblasts. Genome Biol. 13 (12), 121 (2012).
- Hoen, P. A., Hirsch, M., de Meijer, E. J., de Menezes, R. X., van Ommen, G. J., den Dunnen, J. T. mRNA degradation controls differentiation state-dependent differences in transcript and splice variant abundance. Nucleic Acids Res. 39 (2), 556-566 (2011).
- Sharova, L. V., Sharov, A. A., Nedorezov, T., Piao, Y., Shaik, N., Ko, M. S. Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells. DNA Res. 16 (1), 45-58 (2009).
- Johnson, E. L., Robinson, D. G., Coller, H. A. Widespread changes in mRNA stability contribute to quiescence-specific gene expression patterns in a fibroblast model of quiescence. BMC Genomics. 18 (1), 123 (2017).
- Legesse-Miller, A., Elemento, O., Pfau, S. J., Forman, J. J., Tavazoie, S., Coller, H. A. let-7 Overexpression leads to an increased fraction of cells in G2/M, direct down-regulation of Cdc34, and stabilization of Wee1 kinase in primary fibroblasts. J Biol Chem. 284 (11), 6605-6609 (2009).
- Jiang, L., Schlesinger, F., Davis, C. A., Zhang, Y., Li, R., Salit, M., Gingeras, T. R., Oliver, B. Synthetic spike-in standards for RNA-seq experiments. Genome Res. 21 (9), 1543-1551 (2011).
- Tan, P. K., Downey, T. J., Spitznagel, E. L., Xu, P., Fu, D., Dimitrov, D. S., Lempicki, R. A., Raaka, B. M., Cam, M. C. Evaluation of gene expression measurements from commercial microarray platforms. Nucleic Acids Res. 31 (19), 5676-5684 (2003).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Wong, M. L., Medrano, J. F. Real-time PCR for mRNA quantitation. Biotechniques. 39 (1), 75-85 (2005).
- Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nat Protoc. 4 (1), 37-43 (2009).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Anders, S., Reyes, A., Huber, W. Detecting differential usage of exons from RNA-seq data. Genome Res. 22 (10), 2008-2017 (2012).
- Vandenbroucke, I. I., Vandesompele, J., Paepe, A. D., Messiaen, L. Quantification of splice variants using real-time PCR. Nucleic Acids Res. 29 (13), 68-68 (2001).
- Hargrove, J. L., Hulsey, M. G., Beale, E. G. The kinetics of mammalian gene expression. Bioessays. 13 (12), 667-674 (1991).
- Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. Journal of the Royal Statistical Society Series B. 57, 289-300 (1995).
- Hwang, H. W., Wentzel, E. A., Mendell, J. T. Cell-cell contact globally activates microRNA biogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (17), 7016-7021 (2009).
- Friedel, C. C., Dolken, L., Ruzsics, Z., Koszinowski, U. H., Zimmer, R. Conserved principles of mammalian transcriptional regulation revealed by RNA half-life. Nucleic Acids Res. 37 (17), 115 (2009).
- Soeiro, R., Amos, H. mRNA half-life measured by use of actinomycin D in animal cells – A caution. Biochimica et Biophysica Acta. 129 (2), 406-409 (1966).
- Perez-Ortin, J. E., Alepuz, P., Chavez, S., Choder, M. Eukaryotic mRNA decay: methodologies, pathways, and links to other stages of gene expression. J Mol Biol. 425 (20), 3750-3775 (2013).
- Chen, C. Y., Ezzeddine, N., Shyu, A. B. Messenger RNA half-life measurements in mammalian cells. Methods Enzymol. 448, 335-357 (2008).
- Gupta, I., Clauder-Munster, S., Klaus, B., Jarvelin, A. I., Aiyar, R. S., Benes, V., Wilkening, S., Huber, W., Pelechano, V., Steinmetz, L. M. Alternative polyadenylation diversifies post-transcriptional regulation by selective RNA-protein interactions. Mol Syst Biol. 10, 719 (2014).
- Geisberg, J. V., Moqtaderi, Z., Fan, X., Ozsolak, F., Struhl, K. Global analysis of mRNA isoform half-lives reveals stabilizing and destabilizing elements in yeast. Cell. 156 (4), 812-824 (2014).
- Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes. Mol Cell. 31 (6), 925-932 (2008).
- Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay. Nat Biotechnol. 23 (2), 232-237 (2005).
- Rabani, M., Levin, J. Z., Fan, L., Adiconis, X., Raychowdhury, R., Garber, M., Gnirke, A., Nusbaum, C., Hacohen, N., Friedman, N., et al. Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells. Nat Biotechnol. 29 (5), 436-442 (2011).
- Marzi, M. J., Ghini, F., Cerruti, B., de Pretis, S., Bonetti, P., Giacomelli, C., Gorski, M. M., Kress, T., Pelizzola, M., Muller, H., et al. Degradation dynamics of microRNAs revealed by a novel pulse-chase approach. Genome Res. 26 (4), 554-565 (2016).
