Bepalen van genoom-brede Transcript verval tarieven in delende en zwakke menselijke fibroblasten
Summary
We beschrijven een protocol voor genereren prolifererende en zwakke primaire menselijke dermale fibroblasten, monitoring transcript verval tarieven en differentieel rottend genen te identificeren.
Abstract
Onbeweeglijkheid is een tijdelijke, omkeerbare staat in die cellen hebben opgehouden celdeling, maar behouden de capaciteit te verspreiden. Meerdere studies, met inbegrip van ons, hebben aangetoond dat onbeweeglijkheid geassocieerd met grootschalige wijzigingen in genexpressie wordt. Sommige van deze veranderingen ontstaan door veranderingen in het niveau of de activiteit van proliferatie-geassocieerde transcriptiefactoren, zoals E2F en MYC. We hebben aangetoond dat mRNA verval ook aan wijzigingen in genexpressie tussen delende en zwakke cellen bijdragen kan. In dit protocol beschrijven we de procedure voor de vaststelling van delende en rustige culturen van menselijke dermale voorhuid fibroblasten. Vervolgens beschrijven we de procedures voor het remmen van nieuwe transcriptie in delende en zwakke cellen met Actinomycin D (ActD). ActD behandeling vertegenwoordigt een ongecompliceerd en reproduceerbare aanpak te distantiëren van nieuwe transcriptie van transcript verval. Een nadeel van de ActD behandeling is dat het tijdsverloop beperkt blijven tot een kort tijdsbestek moet omdat ActD heeft invloed op de levensvatbaarheid van de cellen. Transcript niveaus worden gecontroleerd na verloop van tijd om te bepalen van transcript verval tarieven. Deze procedure maakt de identificatie van genen en isoforms dat differentiële verval in prolifererende versus zwakke fibroblasten vertonen.
Introduction
Steady state niveaus van afschriften weerspiegelen de bijdrage van zowel transcript synthese en transcript verval. Geregeld en gecoördineerd transcript verval is een belangrijk mechanisme voor de controle op biologische processen1,,2,,3,4. Bijvoorbeeld, is transcript verval tarieven gebleken om bij te dragen aan de temporele reeks van gebeurtenissen na activering door de inflammatoire cytokine tumor necrosis factor5.
Wij hebben eerder aangetoond dat de overgang tussen proliferatie en onbeweeglijkheid in primaire menselijke fibroblasten geassocieerd met veranderingen in het transcript niveaus van veel genen6 wordt. Sommige van deze veranderingen weerspiegelen verschillen in de activiteit van transcriptiefactoren tussen deze twee landen.
Wijzigingen in een transcript van verval tarief kunnen ook bijdragen tot veranderingen in het niveau van de expressie van een transcript in twee verschillende staten7,8. Gebaseerd op onze eerdere bevindingen dat de overgang tussen proliferatie en onbeweeglijkheid geassocieerd met veranderingen in de niveaus van meerdere microRNAs9 wordt, we gevraagd of er ook een bijdrage van differentiële transcript verval in de veranderingen in genexpressie in prolifererende versus zwakke fibroblasten.
Wij vastbesloten om te controleren transcript stabiliteit, het tarief van verval van afschriften genoom-brede in prolifererende versus zwakke cellen. Om dit te bereiken, gecontroleerd we verval tarieven in prolifererende versus zwakke fibroblasten door de invoering van een inhibitor van de omwenteling van nieuwe transcriptie en controle op het tarief waartegen afzonderlijke afschriften na verloop van tijd verdwenen. Het voordeel van deze aanpak is dat, in vergelijking met de methoden die gewoon algemene genexpressie, volgen door remming van de nieuwe transcript synthese, wij zullen kunnen bepalen van het verval tarief voor deze afschriften afzonderlijk van het tarief waartegen ze zijn getranscribeerd.
ActD behandeling bepalen transcript verval tarieven te remmen van nieuwe transcriptie is succesvol toegepast in meerdere Eerdere studies. ActD is gebruikt om het belang van RNA stabiliteit in de wijzigingen in afschrift overvloed die voortvloeien uit behandeling met pro-inflammatoire cytokines5ontleden. Een soortgelijke aanpak is ook gebruikt om de verschillen in afschrift verval tarief in prolifererende versus gedifferentieerde C2C12 cellen als zij vaststellen dat een gedifferentieerde spier fenotype10ontleden. Een ander voorbeeld: global mRNA halfwaardetijd pluripotente ook zijn gevonden en gedifferentieerde muis embryonale stamcellen cellen11. In deze voorbeelden, is mRNA verval aangetoond dat het belangrijk voor de regulering van transcript overvloed en voor de overgang van cellen andere cel toe.
Toepassing van de methoden die hieronder worden beschreven, ontdekt we veranderingen in afschrift verval tarieven in ongeveer 500 genen bij het vergelijken van fibroblasten in delende en zwakke staten12. In het bijzonder, ontdekt hebben we dat de doelstellingen van de microRNA miR-29, die werden in rustige cellen, is gestabiliseerd wanneer cellen overgang naar onbeweeglijkheid. Hier beschrijven we de methodologie die we gebruikt om te bepalen van verval tarieven in delende en zwakke cellen. Deze methode is handig voor het vergelijken van global mRNA verval tarieven in twee verschillende maar vergelijkbare omstandigheden wanneer informatie over snel rottend genen wordt aangevraagd. Het kan ook worden gebruikt om aan te pakken van de andere kwesties, zoals het effect van cel kweekomstandigheden op transcript verval, bijvoorbeeld in twee dimensionale versus drie dimensionale culturen. Verval tarieven kunnen bepaalde genoom-brede met methoden, zoals microarrays of RNA-Seq. alternatief, real-time qPCR of het noordelijke bevlekken kan worden gebruikt om te bepalen van verval tarieven op basis van gen-door-gen of isovorm-door-isovorm. Deze tarieven kunnen vervolgens worden gebruikt voor het berekenen van de halfwaardetijd van elke gecontroleerde gen en om genen te identificeren met de verval-tarieven die in twee voorwaarden verschillen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Onbeweeglijkheid kan worden opgewekt door externe signalen, met inbegrip van intrekking van mitogenen of serum, gebrek aan cel adhesie en remming van de contactpersoon. Contact remming, een van meerdere mogelijke methoden voor inducerende onbeweeglijkheid, is een zeer evolutionair geconserveerde proces waarin cellen de proliferatieve celcyclus in reactie op cel-naar-cel contact sluiten. Hier richten we ons op remming van het contact als een voorbeeld van een methode voor het opwekken van onbeweeglijkheid. Eerdere studies…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
HAC was de Milton E. Cassel geleerde van de Rita Allen Foundation (http://www.ritaallenfoundation.org). Dit werk werd gefinancierd door subsidies voor HAC van het National Institute of General Medical Sciences Center van Excellence subsidie P50 GM071508 (P.I. David Botstein), PhRMA Stichting subsidie 2007RSGl9572, National Science Foundation Grant OCI-1047879 tot en met augustus van David, National Institute of General Medical Sciences R01 GM081686, Rijksinstituut voor algemene medische wetenschappen R01 GM0866465, de Eli & jongevrouw brede centrum van regeneratieve geneeskunde & stamcelonderzoek, de Iris Cantor Women’s Health Center/UCLA CTSI NIH Grant UL1TR000124, en de maatschappij van de leukemie lymfoom. Onderzoek gemeld in deze publicatie werd gesteund door de National Cancer Institute van de National Institutes of Health onder Award nummer P50CA092131. De financiers had geen rol in de studie ontwerp, gegevensverzameling en analyse, besloten tot bekendmaking of voorbereiding van het manuscript. HAC deel uitmaakt van de Eli & jongevrouw brede Center van regeneratieve geneeskunde & stamcelonderzoek, de UCLA moleculaire biologie-instituut, en het UCLA Bioinformatics interdepartementale programma.
Materials
| Centrifuges for microcentrifuge tubes capable of reaching 12,000 x g and 4°C | |||
| Equipment for running agarose gels | |||
| Sterile tissue culture plates and conical tubes | |||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11965-118 | |
| Fetal bovine serum | VWR | 35-010-CV | |
| Sterile serological pipets, pipettors and pipet tips for tissue culture | |||
| Individually wrapped, disposable Rnase-free pipettes, pipette tips and tubes for RNA isolation and analysis | |||
| Disposable gloves to be worn when handling reagents and RNA samples | |||
| RNaseZap | Invitrogen | AM9780 | For decontaminating work surfaces from RNase |
| 2.0 ml eppendorf tubes | |||
| Trypsin-EDTA Solution 10X | Millipore Sigma | 9002-07-07 | |
| Sterile PBS | Life Technologies | 14190-250 | |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Actinomycin D | Millipore Sigma | A1410-2 mg | inhibits transcription |
| Sterile DMSO | Fisher Scientific | 31-761-00ML | solvent for actinomycin D |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | ICN19400225 | MP Biomedicals, Inc product |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618500 | molecular biology grade |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP28184 | molecular biology grade |
| RNase-free Glycogen (20 mg/ml aqueous solution) | Thermo Fisher Scientific | R0551 | carrier for RNA precipitation |
| TURBO DNA-free Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1907 | removes DNA with DNase, then, in a subsequent step, inactivates DNA and removes divalent cations |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific | ICN820721 | MP Biomedicals, Inc product |
| Loading dye for RNA gel | Thermo Fisher Scientific | R0641 | suitable even for denaturing electrophoresis |
| Millenium RNA markers | Thermo Fisher Scientific | AM7150 | RNA ladder |
| One-color RNA Spike-in Kit | Agilent Technology | 5188-5282 | Example spike-in control for Agient microarray analysis |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | molecular biology grade, for TAE buffer |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38-500 | for TAE buffer |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | electrophoresis grade, for gels |
| Ethidium bromide | Millipore Sigma | E7637 | for molecular biology |
| External RNA Controls Consortium RNA Spike-in Mix | Thermo Fisher Scientific | 4456740 | Spike-in control for RNA Seq |
| TruSeq Stranded mRNA Library Preparation Kit A (48 samples, 12 indexes) | Illumina | RS-122-2101 | for RNA Seq |
| 96-well 0.3 ml PCR plate | Thermo Fisher Scientific | AB-0600 | for real-time qPCR |
| Microseal B adhesive seals | Bio-Rad | MSB1001 | for real-time qPCR |
| Rnase/Dnase-free Reagent Reservoirs | VWR | 89094-662 | for real-time qPCR |
| Rnase/Dnase-free Eight tube strips and caps | Thermo Fisher Scientific | AM12230 | for real-time qPCR |
| SuperScript Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18090010 | for real-time qPCR |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63880 | for real-time qPCR |
References
- Neff, A. T., Lee, J. Y., Wilusz, J., Tian, B., Wilusz, C. J. Global analysis reveals multiple pathways for unique regulation of mRNA decay in induced pluripotent stem cells. Genome Res. 22 (8), 1457-1467 (2012).
- Raghavan, A., Ogilvie, R. L., Reilly, C., Abelson, M. L., Raghavan, S., Vasdewani, J., Krathwohl, M., Bohjanen, P. R. Genome-wide analysis of mRNA decay in resting and activated primary human T lymphocytes. Nucleic Acids Res. 30 (24), 5529-5538 (2002).
- Cheadle, C., Fan, J., Cho-Chung, Y. S., Werner, T., Ray, J., Do, L., Gorospe, M., Becker, K. G. Control of gene expression during T cell activation: alternate regulation of mRNA transcription and mRNA stability. BMC Genomics. 6, 75 (2005).
- Yang, E., van Nimwegen, E., Zavolan, M., Rajewsky, N., Schroeder, M., Magnasco, M., Darnell, J. E. Decay rates of human mRNAs: correlation with functional characteristics and sequence attributes. Genome Res. 13 (8), 1863-1872 (2003).
- Hao, S., Baltimore, D. The stability of mRNA influences the temporal order of the induction of genes encoding inflammatory molecules. Nat Immunol. 10 (3), 281-288 (2009).
- Coller, H. A., Sang, L., Roberts, J. M. A new description of cellular quiescence. PLoS Biol. 4 (3), 83 (2006).
- Wilusz, C. J., Wormington, M., Peltz, S. W. The cap-to-tail guide to mRNA turnover. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (4), 237-246 (2001).
- Garneau, N. L., Wilusz, J., Wilusz, C. J. The highways and byways of mRNA decay. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (2), 113-126 (2007).
- Suh, E. J., Remillard, M. Y., Legesse-Miller, A., Johnson, E. L., Lemons, J. M., Chapman, T. R., Forman, J. J., Kojima, M., Silberman, E. S., Coller, H. A. A microRNA network regulates proliferative timing and extracellular matrix synthesis during cellular quiescence in fibroblasts. Genome Biol. 13 (12), 121 (2012).
- Hoen, P. A., Hirsch, M., de Meijer, E. J., de Menezes, R. X., van Ommen, G. J., den Dunnen, J. T. mRNA degradation controls differentiation state-dependent differences in transcript and splice variant abundance. Nucleic Acids Res. 39 (2), 556-566 (2011).
- Sharova, L. V., Sharov, A. A., Nedorezov, T., Piao, Y., Shaik, N., Ko, M. S. Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells. DNA Res. 16 (1), 45-58 (2009).
- Johnson, E. L., Robinson, D. G., Coller, H. A. Widespread changes in mRNA stability contribute to quiescence-specific gene expression patterns in a fibroblast model of quiescence. BMC Genomics. 18 (1), 123 (2017).
- Legesse-Miller, A., Elemento, O., Pfau, S. J., Forman, J. J., Tavazoie, S., Coller, H. A. let-7 Overexpression leads to an increased fraction of cells in G2/M, direct down-regulation of Cdc34, and stabilization of Wee1 kinase in primary fibroblasts. J Biol Chem. 284 (11), 6605-6609 (2009).
- Jiang, L., Schlesinger, F., Davis, C. A., Zhang, Y., Li, R., Salit, M., Gingeras, T. R., Oliver, B. Synthetic spike-in standards for RNA-seq experiments. Genome Res. 21 (9), 1543-1551 (2011).
- Tan, P. K., Downey, T. J., Spitznagel, E. L., Xu, P., Fu, D., Dimitrov, D. S., Lempicki, R. A., Raaka, B. M., Cam, M. C. Evaluation of gene expression measurements from commercial microarray platforms. Nucleic Acids Res. 31 (19), 5676-5684 (2003).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Wong, M. L., Medrano, J. F. Real-time PCR for mRNA quantitation. Biotechniques. 39 (1), 75-85 (2005).
- Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nat Protoc. 4 (1), 37-43 (2009).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Anders, S., Reyes, A., Huber, W. Detecting differential usage of exons from RNA-seq data. Genome Res. 22 (10), 2008-2017 (2012).
- Vandenbroucke, I. I., Vandesompele, J., Paepe, A. D., Messiaen, L. Quantification of splice variants using real-time PCR. Nucleic Acids Res. 29 (13), 68-68 (2001).
- Hargrove, J. L., Hulsey, M. G., Beale, E. G. The kinetics of mammalian gene expression. Bioessays. 13 (12), 667-674 (1991).
- Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. Journal of the Royal Statistical Society Series B. 57, 289-300 (1995).
- Hwang, H. W., Wentzel, E. A., Mendell, J. T. Cell-cell contact globally activates microRNA biogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (17), 7016-7021 (2009).
- Friedel, C. C., Dolken, L., Ruzsics, Z., Koszinowski, U. H., Zimmer, R. Conserved principles of mammalian transcriptional regulation revealed by RNA half-life. Nucleic Acids Res. 37 (17), 115 (2009).
- Soeiro, R., Amos, H. mRNA half-life measured by use of actinomycin D in animal cells – A caution. Biochimica et Biophysica Acta. 129 (2), 406-409 (1966).
- Perez-Ortin, J. E., Alepuz, P., Chavez, S., Choder, M. Eukaryotic mRNA decay: methodologies, pathways, and links to other stages of gene expression. J Mol Biol. 425 (20), 3750-3775 (2013).
- Chen, C. Y., Ezzeddine, N., Shyu, A. B. Messenger RNA half-life measurements in mammalian cells. Methods Enzymol. 448, 335-357 (2008).
- Gupta, I., Clauder-Munster, S., Klaus, B., Jarvelin, A. I., Aiyar, R. S., Benes, V., Wilkening, S., Huber, W., Pelechano, V., Steinmetz, L. M. Alternative polyadenylation diversifies post-transcriptional regulation by selective RNA-protein interactions. Mol Syst Biol. 10, 719 (2014).
- Geisberg, J. V., Moqtaderi, Z., Fan, X., Ozsolak, F., Struhl, K. Global analysis of mRNA isoform half-lives reveals stabilizing and destabilizing elements in yeast. Cell. 156 (4), 812-824 (2014).
- Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes. Mol Cell. 31 (6), 925-932 (2008).
- Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay. Nat Biotechnol. 23 (2), 232-237 (2005).
- Rabani, M., Levin, J. Z., Fan, L., Adiconis, X., Raychowdhury, R., Garber, M., Gnirke, A., Nusbaum, C., Hacohen, N., Friedman, N., et al. Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells. Nat Biotechnol. 29 (5), 436-442 (2011).
- Marzi, M. J., Ghini, F., Cerruti, B., de Pretis, S., Bonetti, P., Giacomelli, C., Gorski, M. M., Kress, T., Pelizzola, M., Muller, H., et al. Degradation dynamics of microRNAs revealed by a novel pulse-chase approach. Genome Res. 26 (4), 554-565 (2016).
