Expresión de antígenos exógenos en la vacuna de BCG de Mycobacterium bovis por genética no decoración de superficie con el sistema avidina-biotina
Summary
Se presenta una nueva técnica para la visualización rápida de antígeno en una superficie bacteriana, que implica la Biotinilación superficial seguida por la exposición a las proteínas de interés en fusión con avidina monomérica. Carga del BCG con antígenos seleccionados con éxito mejora su inmunogenicidad, lo que sugiere que la decoración superficial puede sustituir los métodos genéticos tradicionales.
Abstract
La tuberculosis (TB) es una enfermedad infecciosa grave y el bacilo de M. bovis sólo disponible vacuna de Calmette-Guerin (BCG) es seguro y eficaz para la protección contra la meningitis de TB severa de los niños y algunas formas de tuberculosis diseminada, pero no protege contra la tuberculosis pulmonar, que es la forma más prevalente de la enfermedad. Estrategias prometedoras para mejorar la BCG en la actualidad basan en su transformación con genes que codifican inmunodominante M. tuberculosis (Mtb)-antígenos específicos o complementación con genes que codifican factores que estimularían el antígeno las células presentadoras. Principales limitaciones de estos enfoques incluyen el incierto nivel de seguridad de los vectores de expresión, baja eficiencia y baja estabilidad. En este estudio, presentamos un enfoque alternativo a la mejora de la vacuna, que consiste en complementación de BCG con proteínas exógenas de interés en la superficie de las bacterias, en lugar de transformación con los plásmidos codifican genes correspondientes. En primer lugar, las proteínas de interés se expresan en fusión con avidina monomérica en estándar e. coli sistemas de expresión y utilizarlas para decorar la superficie de biotinilado BCG. Con superficie de BCG con antígenos de sustituta ovoalbúmina los experimentos con animales demuestran que la bacteria modificada completamente inmunogénica y capaces de inducir respuestas de células T específicas. En conjunto, los datos presentados aquí fuertemente apoyan un novedoso y eficaz método para remodelar la actual vacuna BCG que reemplaza el enfoque convencional laborioso de complementación con ácidos nucleicos exógenos.
Introduction
Diversas estrategias se han propuesto para reemplazar la actual vacuna TB BCG, incluyendo proteína adyuvante sistemas, tecnologías virales virales, cepas de m. vivo atenuadas y modificadas genéticamente cepas de BCG, ya sea para introducir genes sobre-expresan antígenos de BCG que no expresan suficientemente durante la infección1 o Mtb-antígenos específicos no presentan en BCG2. Ingeniería genética, sin embargo, se enfrenta a muchas barreras incluyendo el incierto nivel de seguridad, el proceso desperdiciador de tiempo y la baja eficiencia de expresión vectores4,5. Con respecto a la mejora de la BCG, es necesario un enfoque alternativo para mejorar la inmunogenicidad sin necesidad de alteraciones genéticas inciertos.
En este estudio, presentamos una nueva estrategia para la visualización de proteínas recombinantes de interés en la superficie celular de BCG que se basa en la interacción bien conocida de alta afinidad de avidina con biotina. Este enfoque permite el accesorio rápido y reproducible avidina recombinante de proteínas de fusión en la superficie de biotinilado BCG, que facilita las manipulaciones amplia de BCG para lograr un perfeccionamiento máximo de su eficacia manteniendo su excelente seguridad registro, observado durante décadas de uso.
Avidina afinidad para la biotina es extremadamente alta (Kd = 10−15 M) y una vez formado, el complejo biotina-avidina es muy estable y sólo puede ser interrumpido bajo desnaturalizar condiciones6. Sin embargo, para este tipo de interacción para servir como una alternativa de método de transferencia génica, exposición a largo plazo pero reversible de proteínas recombinantes se requiere. Por lo tanto, aquí presentamos una avidina monomérica de baja afinidad (Kd = 10−7 M) que conduce a la liberación reversible de la proteína de la superficie decorada BCG una vez ingerido dentro de las células presentadoras de antígeno. Con el fin de proporcionar una prueba de concepto, probamos este método utilizando una proteína quimérica de avidina monomérica corresponde a un antígeno de sustituto derivado de ovoalbúmina (OVA)7,8. Los resultados mostraron que la superficie de la célula de BCG puede ser fácilmente y rápidamente decorada con proteínas de fusión de avidina monomérica y que esta Unión a la superficie de la BCG es estable y reproducible sin cambios perceptibles en el crecimiento bacteriano y la supervivencia. También, encontramos que la BCG con avidina monomérica con óvulos (AviOVA) puede inducir una respuesta inmune similar a la inducida por la BCG genéticamente expresando el mismo antígeno tanto in vitro como in vivo. Esta tecnología de pantalla reversible de proteínas de interés en la superficie bacteriana es un efectivo reemplazo de enfoques de transferencia génica tradicional y puede proporcionar una plataforma para grandes manipulaciones de BCG y otras aplicaciones de vacuna desarrollo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Reportamos en este estudio un enfoque no genéticos para la visualización rápida y eficaz de proteínas exógenas en superficie de BCG para añadir antígenos específicos o propiedades funcionales específicas previstos mejorar eficientemente la inmunogenicidad de la bacteria. Hemos demostrado que la superficie de la célula de BCG podría ser fácilmente biotinilado para decoración instantánea de la superficie con proteínas de fusión de la avidina. El procedimiento total puede realizarse dentro de 2 h, mientras q…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Dr. R Stokes para la cepa BCG Pasteur y Talal A. para soporte técnico. También agradecemos GenScript ayuda con síntesis del gene.
Materials
| Endotoxin-free RPMI 1640 | StemCell Technologies | 36750 | |
| Sulfo-NHS SS biotin | Thermo Fisher | 21328 | |
| FITC-conjugated streptavidin | Sigma-Aldrich | S3762 | |
| Phycoerythrin (PE)-conjugated I-Ab-OVA323-339 tetramer | MBL International | TS-M710-1 | |
| 7-AAD | BD Pharmingen | 559925 | |
| TALON polyhistidine-Tag purification resin | Clontech | 635501 | |
| Alexa Fluor (AF) 647 conjugated rat anti-mouse CD4 | BD Bioscience | 557681 | |
| AF647 rat anti-mouse IFN-g | BD Bioscience | 557735 | |
| AF647 rat anti-mouse I-A/I-E | BD Bioscience | 562367 | |
| PeCy7 rat anti-mouse CD4 | BD Bioscience | 552775 | |
| PE rat anti-mouse CD8 Ab | BD Bioscience | 561095 | |
| AF 647 rat anti-mouse H-2kb | BD Bioscience | 562832 | |
| FITC-conjugated goat anti rabbit antibody | Thermo Fisher | 31635 | |
| AF 647 rat anti-mouse CD4 | BD Bioscience | 557681 | |
| Ultra-small gold-conjugated goat anti-rabbit IgG | Electron Microscopy Sciences | 25100 | |
| Middlebrook 7H9 broth | BD Diagnostic Systems | 271310 | |
| OADC | BD Diagnostic Systems | B11886 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| RAW 264.7 murine macrophage cell lines | American Type Culture Collection | ||
| pDEST17 plasmid | Invitrogen | 11803012 | |
| pUC57-OVA plasmid | GenScript | SD1176 | |
| BP clonase | Invitrogen | 11789020 | |
| LR clonase | Invitrogen | 11791043 | |
| pDONR221 plasmid | Invitrogen | 12536017 | |
| Ni-NTA columns | Qiagen | 31014 | |
| Pierce protein concentrators | Thermo Fisher | 88527 | |
| Flurosave | Calbiochem-Novabiochem | 345789 | |
| Axioplan II epifluorescence microscope | Carl Zeiss Inc | ||
| CCD digital camera | Retiga EX, QImaging | ||
| Tecnai G2 200kV electron microscope | FEI Company | G2 200Kv | |
| 70μm Falcon cell strainer | Thermo Fisher | 87712 | |
| EasyStep mouse biotin positive selection kit | StemCell | 18556 | |
| biotin-Ter119/Ertyroid cells antibody | BioLegend | 116203 | |
| Brefeldin A | BD Pharmingen | 555029 | |
| Cytofix/Cytoperm kit | BD Pharmingen | 554714 | |
| Bright-Glo Luciferase assay system | Promega | e2620 | |
| Turner Biosystem luminometer | Promega | TD-20/20 | |
| Leica EM UC6 microtome | Leica Microsystems | UC6 | |
| Novalyphe NL 500 freeze dryer | Savant Instruments | NL 50 | |
| Wheaton boroscilicate glass vials | Wheaton | VWR 66011-675 |
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