Выражение Экзогенные антигены в вакцины БЦЖ Mycobacterium bovis через Non генетические поверхности украшения с системой авидин биотин
Summary
Представлен Роман технику для быстрого антигена отображения на бактериальных поверхности, которая включает поверхности biotinylation последующим воздействием протеинов интереса в fusion с мономерных авидин. Загрузка БЦЖ с выбранной антигены успешно улучшает его иммуногенность, предполагая, что поверхности украшения может заменить традиционные генетические подходы.
Abstract
Туберкулез (ТБ) является серьезных инфекционных заболеваний и доступны только вакцина M. bovis бациллы Кальметта-Герена (БЦЖ) является безопасным и эффективным для защиты от детей с тяжелой Туберкулезный менингит и некоторых форм распространения туберкулеза, но не может защитить против туберкулеза легких, которая является наиболее распространенной формой заболевания. Перспективные стратегии по улучшению БЦЖ в настоящее время опираются либо на ее преобразование с гены, кодирующие immunodominant микобактерий туберкулеза (Mtb)-специфических антигенов и/или дополнения с гены, кодирующие сопутствующие факторы, стимулирующие антигена Представляя клеток. Основные ограничения на эти подходы включают низкая эффективность, низкая стабильность и неопределенность уровня безопасности векторов выражения. В этом исследовании мы представляем альтернативный подход к улучшению вакцина, которая состоит из БЦЖ взаимодополняемости с экзогенной протеинов интереса на поверхности бактерий, вместо преобразования с плазмид кодирования соответствующих генов. Во-первых, протеинов интереса выражаются в fusion с мономерных авидин в стандартных E. coli системы выражения и затем используется для украшения поверхности биотинилированным БЦЖ. Эксперименты на животных с использованием поверхности БЦЖ, украшенные суррогатной овальбумина антигена продемонстрировать, что измененные бактерии полностью иммуногенность и способны индуцировать Т-клеток конкретных ответов. В целом данные, представленные здесь сильно поддержка Роман и эффективный метод меняет текущий вакцины БЦЖ, который заменяет трудоемкий подход обычных взаимодополняемости с экзогенной нуклеиновых кислот.
Introduction
Чтобы заменить текущий туберкулеза вакцины БЦЖ, включая белка адъювантной систем, вирусный векторной технологии, аттенуированные штаммы живой M.tb и генетически модифицированных штаммов БЦЖ, либо ввести гены были предложены различные стратегии чрезмерно выражая БЦЖ антигены, которые не выразили достаточно во время инфекции1 или Mtb-специфических антигенов не представляют в БЦЖ2. Генная инженерия, однако, сталкивается множество барьеров, включая неопределенность уровень безопасности, трудоемкий процесс и низкая эффективность выражения векторов4,5. Что касается улучшения БЦЖ, альтернативный подход необходима для повышения иммуногенности без необходимости неопределенной генетических изменений.
В этом исследовании мы представляем новую стратегию для отображения рекомбинантных протеинов интереса на поверхности клеток БЦЖ, которая основана на известной высокоспецифичные авидин взаимодействие с биотин. Этот подход позволяет быстрое и воспроизводимые вложение рекомбинантных авидин синтез белков на поверхности биотинилированным БЦЖ, который способствует широкий манипуляции БЦЖ для достижения максимального улучшения его эффективность при сохранении его отличную безопасность Запишите, что наблюдавшееся в течение десятилетий использования.
Авидин сродство для биотина чрезвычайно высока (Kd = 10−15 М) и после того, как сформирована, биотин авидин комплекс очень стабильна и может быть нарушена только под денатурации условия6. Однако для этого типа взаимодействия в качестве альтернативного метода передачи гена, требуется долгосрочный но обратимые отображения рекомбинантных белков. Таким образом, мы представили здесь низкого сродства мономерных авидин (Kd = 10−7 М) приводит к обратимым выпуска белка от поверхности украшены БЦЖ раз попадает внутрь антиген представляющих клеток. Для того, чтобы предоставить доказательство концепции, мы протестировали этот метод с помощью мономерных авидин химерных белка, соответствующий суррогат антигена, производный от овальбумина (OVA)7,8. Результаты показали, что БЦЖ клеточной поверхности могут быть легко и быстро украшены мономерных авидин синтез белков и что эта привязка к поверхности БЦЖ является стабильным и воспроизводимые без обнаружить изменения в бактериальных роста и выживания. Кроме того, мы обнаружили, что БЦЖ, украшенные мономерных авидин сливается с OVA (AviOVA) может вызвать иммунный ответ аналогичен индуцированных БЦЖ генетически выражая же антигена в пробирке и в естественных условиях. Эта технология реверсивные отображения протеинов интереса на поверхности бактериальной поэтому является эффективной заменой традиционных гена передачи подходов и может обеспечить платформу для широкого манипуляций БЦЖ и дальнейшего применения вакцины развития.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы сообщали в этом исследовании Негенетические подход для быстрого и эффективного отображения внешних белков на поверхности БЦЖ добавить конкретные антигены или конкретных функциональных свойств, ожидается эффективного повышения иммуногенности бактерии. Мы продемонстрировали, что…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим д-р R Стоукс для штамма БЦЖ Пастер и Талал A. для технической поддержки. Мы также благодарим GenScript за помощь с Джин синтеза.
Materials
| Endotoxin-free RPMI 1640 | StemCell Technologies | 36750 | |
| Sulfo-NHS SS biotin | Thermo Fisher | 21328 | |
| FITC-conjugated streptavidin | Sigma-Aldrich | S3762 | |
| Phycoerythrin (PE)-conjugated I-Ab-OVA323-339 tetramer | MBL International | TS-M710-1 | |
| 7-AAD | BD Pharmingen | 559925 | |
| TALON polyhistidine-Tag purification resin | Clontech | 635501 | |
| Alexa Fluor (AF) 647 conjugated rat anti-mouse CD4 | BD Bioscience | 557681 | |
| AF647 rat anti-mouse IFN-g | BD Bioscience | 557735 | |
| AF647 rat anti-mouse I-A/I-E | BD Bioscience | 562367 | |
| PeCy7 rat anti-mouse CD4 | BD Bioscience | 552775 | |
| PE rat anti-mouse CD8 Ab | BD Bioscience | 561095 | |
| AF 647 rat anti-mouse H-2kb | BD Bioscience | 562832 | |
| FITC-conjugated goat anti rabbit antibody | Thermo Fisher | 31635 | |
| AF 647 rat anti-mouse CD4 | BD Bioscience | 557681 | |
| Ultra-small gold-conjugated goat anti-rabbit IgG | Electron Microscopy Sciences | 25100 | |
| Middlebrook 7H9 broth | BD Diagnostic Systems | 271310 | |
| OADC | BD Diagnostic Systems | B11886 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| RAW 264.7 murine macrophage cell lines | American Type Culture Collection | ||
| pDEST17 plasmid | Invitrogen | 11803012 | |
| pUC57-OVA plasmid | GenScript | SD1176 | |
| BP clonase | Invitrogen | 11789020 | |
| LR clonase | Invitrogen | 11791043 | |
| pDONR221 plasmid | Invitrogen | 12536017 | |
| Ni-NTA columns | Qiagen | 31014 | |
| Pierce protein concentrators | Thermo Fisher | 88527 | |
| Flurosave | Calbiochem-Novabiochem | 345789 | |
| Axioplan II epifluorescence microscope | Carl Zeiss Inc | ||
| CCD digital camera | Retiga EX, QImaging | ||
| Tecnai G2 200kV electron microscope | FEI Company | G2 200Kv | |
| 70μm Falcon cell strainer | Thermo Fisher | 87712 | |
| EasyStep mouse biotin positive selection kit | StemCell | 18556 | |
| biotin-Ter119/Ertyroid cells antibody | BioLegend | 116203 | |
| Brefeldin A | BD Pharmingen | 555029 | |
| Cytofix/Cytoperm kit | BD Pharmingen | 554714 | |
| Bright-Glo Luciferase assay system | Promega | e2620 | |
| Turner Biosystem luminometer | Promega | TD-20/20 | |
| Leica EM UC6 microtome | Leica Microsystems | UC6 | |
| Novalyphe NL 500 freeze dryer | Savant Instruments | NL 50 | |
| Wheaton boroscilicate glass vials | Wheaton | VWR 66011-675 |
References
- Horwitz, M. A., Harth, G. A new vaccine against tuberculosis affords greater survival after challenge than the current vaccine in the guinea pig model of pulmonary tuberculosis. Infect. Immun. 71 (4), 1672-1679 (2003).
- Pym, A. S., et al. Recombinant BCG exporting ESAT-6 confers enhanced protection against tuberculosis. Nat Med. 9 (5), 548-553 (2003).
- Grode, L., et al. Increased vaccine efficacy against tuberculosis of recombinant Mycobacterium bovis bacille Calmette-Guerin mutants that secrete listeriolysin. The J Clin Invest. 115 (9), 2472-2479 (2005).
- Bastos, R. G., Borsuk, S., Seixas, F. K., Dellagostin, O. A. Recombinant Mycobacterium bovis BCG. Vaccine. 27 (47), 6495-6503 (2009).
- Mederle, I., et al. Plasmidic versus insertional cloning of heterologous genes in Mycobacterium bovis BCG: impact on in vivo antigen persistence and immune responses. Infect Immun. 70 (1), 303-314 (2002).
- Singh, N. P., et al. A Novel Approach to Cancer Immunotherapy Tumor Cells Decorated with CD80 Generate Effective Antitumor Immunity A Novel Approach to Cancer Immunotherapy Tumor Cells Decorated with CD80 Generate Effective Antitumor Immunity. Cancer Res. 63 (14), 4067-4073 (2003).
- Oizumi, S., Strbo, N., Pahwa, S., Deyev, V., Podack, E. R. Molecular and cellular requirements for enhanced antigen cross-presentation to CD8 cytotoxic T lymphocytes. J Immunol. 179 (4), 2310-2317 (2007).
- Sharif-Paghaleh, E., et al. Monitoring the efficacy of dendritic cell vaccination by early detection of (99m) Tc-HMPAO-labelled CD4(+) T cells. Eur J Immunol. 44 (7), 2188-2191 (2014).
- Sun, J., et al. A broad-range of recombination cloning vectors in mycobacteria. Plasmid. 62 (3), 158-165 (2009).
- Laitinen, O. H., et al. Rational design of an active avidin monomer. J. Biol. Chem. 278 (6), 4010-4014 (2003).
- Flynn, J. L., Chan, J., Triebold, K. J., Dalton, D. K., Stewart, T. A., Bloom, B. R. An essential role for interferon gamma in resistance to Mycobacterium tuberculosis infection. J Exp Med. 178 (6), 2249-2254 (1993).
- Liao, T. Y. A., Lau, A., Joseph, S., Hytonen, V., Hmama, Z. Improving the immunogenicity of the Mycobacterium bovis BCG vaccine by non-genetic bacterial surface decoration using the avidin-biotin system. PLoS ONE. 10 (12), e0145833 (2015).
- Green, N. M. Avidin and streptavidin. Methods Enzymol. 184, 51-67 (1990).
- Howarth, M., Takao, K., Hayashi, Y., Ting, A. Y. Targeting quantum dots to surface proteins in living cells with biotin ligase. PNAS. 102 (21), 7583-7588 (2005).
- Lesch, H. P., Kaikkonen, M. U., Pikkarainen, J. T., Yla-Herttuala, S. Avidin-biotin technology in targeted therapy. Expert Opin Drug Deliv. 7 (5), 551-564 (2010).
- Paganelli, G., Bartolomei, M., Grana, C., Ferrari, M., Rocca, P., Chinol, M. Radioimmunotherapy of brain tumor. Neurol Res. 28 (5), 518-522 (2006).
- Cummings, J. F., et al. Safety and immunogenicity of a plant-produced recombinant monomer hemagglutinin-based influenza vaccine derived from influenza A (H1N1)pdm09 virus: a Phase 1 dose-escalation study in healthy adults. Vaccine. 32 (19), 2251-2259 (2014).
- Kolotilin, I., et al. Plant-based solutions for veterinary immunotherapeutics and prophylactics. Vet Res. 45, 114-117 (2014).
- Demonte, D., Drake, E. J., Lim, K. H., Gulick, A. M., Park, S. Structure-based engineering of streptavidin monomer with a reduced biotin dissociation rate. Proteins. 81 (9), 1621-1633 (2013).
- Deghmane, A. E., et al. Lipoamide dehydrogenase mediates retention of coronin-1 on BCG vacuoles, leading to arrest in phagosome maturation. J Cell Sci. 120 (19), 3489-3489 (2007).
- Soualhine, H., et al. Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin secreting active cathepsin S stimulates expression of mature MHC class II molecules and antigen presentation in human macrophages. J Immunol. 179 (8), 5137-5145 (2007).
- Bubb, M. O., Green, F., Conradie, J. D., Tchernyshev, B., Bayer, E. A., Wilchek, M. Natural antibodies to avidin in human serum. ImmunolLett. 35 (3), 277-280 (1993).
- Petronzelli, F., et al. Therapeutic use of avidin is not hampered by antiavidin antibodies in humans. Cancer Biother Radiopharm. 25 (5), 563-570 (2010).
- Bigini, P., et al. In vivo fate of avidin-nucleic acid nanoassemblies as multifunctional diagnostic tools. ACS Nano. 8 (1), 175-187 (2014).
