Ausdruck der exogene Antigene im Mycobacterium Bovis BCG Impfstoff über nicht-genetische Oberfläche Dekoration mit dem Avidin-Biotin-System
Summary
Eine neuartige Technik für schnelle Antigen-Anzeige auf eine bakterielle Oberfläche präsentiert, die Oberfläche Biotinylierungen, gefolgt von Exposition gegenüber Proteine des Interesses an Fusion mit Monomeren Avidin beinhaltet. Laden von BCG mit ausgewählten Antigene erfolgreich verbessert seine Immunogenität, was darauf hindeutet, dass Oberflächendekoration traditionelle gentechnische Ansätze ersetzen kann.
Abstract
Tuberkulose (TB) ist eine schwere Infektionskrankheit und die einzige verfügbare Impfstoff M. Bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG) ist sicher und wirksam für Schutz gegen Kinder schwere TB Meningitis und einige Formen von disseminierter TB, aber schützt nicht gegen Lungentuberkulose die häufigste Form der Erkrankung ist. Vielversprechende Strategien zur Verbesserung der BCG derzeit verlassen entweder auf ihre Transformation mit Genen Codierung immundominante M. Tuberculosis (Mtb)-spezifische Antigene und/oder Ergänzung mit Genen Codierung Co-Faktoren, die Antigen stimulieren würde Zellen zu präsentieren. Wesentliche Einschränkungen zu diesen Ansätzen zählen geringe Effizienz, geringe Stabilität und das ungewisse Sicherheitsniveau der Expressionsvektoren. In dieser Studie stellen wir einen alternativen Ansatz zur Impfstoff-Verbesserung, bestehend aus BCG Ergänzung mit exogene Proteine auf der Oberfläche der Bakterien, sondern als Transformation mit entsprechenden Gene Kodierung Plasmide. Erstens interessierender Proteine in Verschmelzung mit Monomeren Avidin im standard E. Coli ausgedrückt werden Expressionssysteme und dann verwendet, um die Oberfläche der biotinylierte BCG zu schmücken. Tierversuche mit BCG Oberfläche verziert mit Surrogat Ovalbumin Antigen nachweisen, dass das geänderte Bakterium vollständig immunogen und in der Lage, spezifische T-Zell-Reaktionen induzieren. Insgesamt unterstützen nachdrücklich die hier vorgestellten Daten eine neuartige und effiziente Methode für die Neugestaltung der aktuellen BCG-Impfstoff, die den mühsamen konventionellen Ansatz der Ergänzung durch exogene Nukleinsäuren ersetzt.
Introduction
Verschiedene Strategien sind vorgeschlagen worden, um die aktuelle TB-Impfstoff BCG, einschließlich Protein adjuvante Systeme, virale vektorieller Technologien, abgeschwächte live M.tb Stämme und genetisch veränderten BCG-Stämmen entweder Gene einzuführen zu ersetzen über Ausdruck BCG-Antigene, die während der Infektion1 oder Mtbnicht hinreichend zum Ausdruck-spezifische Antigene bei BCG2nicht vorhanden. Gentechnik, steht jedoch viele Hindernisse einschließlich der unsicheren Ebene der Sicherheit, die zeitraubende und die geringe Effizienz der Ausdruck Vektoren4,5. Im Hinblick auf die Verbesserung der BCG, ist ein alternativer Ansatz zur Immunogenität ohne die Notwendigkeit einer unsicheren genetische Alternationen Verbesserung notwendig.
In dieser Studie stellen wir eine neue Strategie für die Anzeige der rekombinante Proteine auf der Zelloberfläche von BCG, die auf die bekannte hohe Affinität Avidin Interaktion mit Biotin basiert. Dieser Ansatz ermöglicht schnelle und reproduzierbare Befestigung des rekombinanten Avidin Schmelzverfahren Proteine auf der Oberfläche der biotinylierte BCG, die breitere Manipulationen von BCG, maximale Verbesserung ihrer Wirksamkeit unter Beibehaltung seiner ausgezeichneten Sicherheit zu erreichen erleichtert Zeichnen Sie auf, über Jahrzehnte beobachtet.
Avidin Affinität für Biotin ist extrem hoch (Kd = 10−15 M) und sobald gebildet, die Avidin-Biotin-Komplex ist sehr stabil und kann nur unter denaturierenden Bedingungen6gestört werden. Für diese Art der Interaktion, als gen-Transfer-Methode Alternative zu dienen, ist jedoch langfristig aber reversibel Anzeige von rekombinanten Proteinen erforderlich. Damit wir hier eine geringe Affinität Monomeren Avidin eingeführt (Kd = 10−7 M) führt zur reversiblen Freisetzung des Proteins von der Oberfläche BCG einmal eingenommen innen antigenpräsentierende Zellen versehen. Um ein Proof of Concept zu bieten, haben wir diese Methode mit einem Monomeren Avidin Chimären Protein entspricht ein Surrogat-Antigen abgeleitet von Ovalbumin (OVA)7,8getestet. Die Ergebnisse zeigten, dass die BCG-Zelle-Oberfläche einfach und schnell mit Monomeren Avidin Fusionsproteine dekoriert werden kann und dass diese Bindung an die BCG-Oberfläche stabil und ohne erkennbare Veränderungen in bakterielles Wachstum und überleben reproduzierbar ist. Auch wir fanden, dass BCG dekoriert mit Monomeren Avidin fusioniert mit Eizellen (AviOVA) eine ähnlich dem von BCG induzierte Immunantwort induzieren kann genetisch dasselbe Antigen ausdrücken in Vitro und in Vivo. Diese Technologie umschaltbare Anzeige der Proteine des Interesses auf der bakteriellen Oberfläche ist daher eine effektive Ersatz von traditionellen gen Übertragung Ansätze und kann bieten eine Plattform für breiten Manipulationen der BCG und weitere Anwendungen im Impfstoff Entwicklung.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dieser Studie berichten wir einen nicht-genetische Ansatz für schnelle und effektive Darstellung der exogene Proteine auf BCG Oberfläche hinzufügen entweder spezifische Antigene oder bestimmte funktionale Eigenschaften erwartet, dass das Bakterium Immunogenität effizient zu verbessern. Wir bewiesen, dass die BCG-Zelloberfläche biotinylierte für sofortige Oberflächendekoration mit Avidin Fusionsproteine leicht sein könnte. Das gesamte Verfahren kann innerhalb von 2 h, während genetische Veränderung und Selekt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. R Stokes für die BCG Pasteur Belastung und A. Talal für den technischen Support. Wir danken auch GenScript für Hilfe bei der Gensynthese.
Materials
| Endotoxin-free RPMI 1640 | StemCell Technologies | 36750 | |
| Sulfo-NHS SS biotin | Thermo Fisher | 21328 | |
| FITC-conjugated streptavidin | Sigma-Aldrich | S3762 | |
| Phycoerythrin (PE)-conjugated I-Ab-OVA323-339 tetramer | MBL International | TS-M710-1 | |
| 7-AAD | BD Pharmingen | 559925 | |
| TALON polyhistidine-Tag purification resin | Clontech | 635501 | |
| Alexa Fluor (AF) 647 conjugated rat anti-mouse CD4 | BD Bioscience | 557681 | |
| AF647 rat anti-mouse IFN-g | BD Bioscience | 557735 | |
| AF647 rat anti-mouse I-A/I-E | BD Bioscience | 562367 | |
| PeCy7 rat anti-mouse CD4 | BD Bioscience | 552775 | |
| PE rat anti-mouse CD8 Ab | BD Bioscience | 561095 | |
| AF 647 rat anti-mouse H-2kb | BD Bioscience | 562832 | |
| FITC-conjugated goat anti rabbit antibody | Thermo Fisher | 31635 | |
| AF 647 rat anti-mouse CD4 | BD Bioscience | 557681 | |
| Ultra-small gold-conjugated goat anti-rabbit IgG | Electron Microscopy Sciences | 25100 | |
| Middlebrook 7H9 broth | BD Diagnostic Systems | 271310 | |
| OADC | BD Diagnostic Systems | B11886 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| RAW 264.7 murine macrophage cell lines | American Type Culture Collection | ||
| pDEST17 plasmid | Invitrogen | 11803012 | |
| pUC57-OVA plasmid | GenScript | SD1176 | |
| BP clonase | Invitrogen | 11789020 | |
| LR clonase | Invitrogen | 11791043 | |
| pDONR221 plasmid | Invitrogen | 12536017 | |
| Ni-NTA columns | Qiagen | 31014 | |
| Pierce protein concentrators | Thermo Fisher | 88527 | |
| Flurosave | Calbiochem-Novabiochem | 345789 | |
| Axioplan II epifluorescence microscope | Carl Zeiss Inc | ||
| CCD digital camera | Retiga EX, QImaging | ||
| Tecnai G2 200kV electron microscope | FEI Company | G2 200Kv | |
| 70μm Falcon cell strainer | Thermo Fisher | 87712 | |
| EasyStep mouse biotin positive selection kit | StemCell | 18556 | |
| biotin-Ter119/Ertyroid cells antibody | BioLegend | 116203 | |
| Brefeldin A | BD Pharmingen | 555029 | |
| Cytofix/Cytoperm kit | BD Pharmingen | 554714 | |
| Bright-Glo Luciferase assay system | Promega | e2620 | |
| Turner Biosystem luminometer | Promega | TD-20/20 | |
| Leica EM UC6 microtome | Leica Microsystems | UC6 | |
| Novalyphe NL 500 freeze dryer | Savant Instruments | NL 50 | |
| Wheaton boroscilicate glass vials | Wheaton | VWR 66011-675 |
References
- Horwitz, M. A., Harth, G. A new vaccine against tuberculosis affords greater survival after challenge than the current vaccine in the guinea pig model of pulmonary tuberculosis. Infect. Immun. 71 (4), 1672-1679 (2003).
- Pym, A. S., et al. Recombinant BCG exporting ESAT-6 confers enhanced protection against tuberculosis. Nat Med. 9 (5), 548-553 (2003).
- Grode, L., et al. Increased vaccine efficacy against tuberculosis of recombinant Mycobacterium bovis bacille Calmette-Guerin mutants that secrete listeriolysin. The J Clin Invest. 115 (9), 2472-2479 (2005).
- Bastos, R. G., Borsuk, S., Seixas, F. K., Dellagostin, O. A. Recombinant Mycobacterium bovis BCG. Vaccine. 27 (47), 6495-6503 (2009).
- Mederle, I., et al. Plasmidic versus insertional cloning of heterologous genes in Mycobacterium bovis BCG: impact on in vivo antigen persistence and immune responses. Infect Immun. 70 (1), 303-314 (2002).
- Singh, N. P., et al. A Novel Approach to Cancer Immunotherapy Tumor Cells Decorated with CD80 Generate Effective Antitumor Immunity A Novel Approach to Cancer Immunotherapy Tumor Cells Decorated with CD80 Generate Effective Antitumor Immunity. Cancer Res. 63 (14), 4067-4073 (2003).
- Oizumi, S., Strbo, N., Pahwa, S., Deyev, V., Podack, E. R. Molecular and cellular requirements for enhanced antigen cross-presentation to CD8 cytotoxic T lymphocytes. J Immunol. 179 (4), 2310-2317 (2007).
- Sharif-Paghaleh, E., et al. Monitoring the efficacy of dendritic cell vaccination by early detection of (99m) Tc-HMPAO-labelled CD4(+) T cells. Eur J Immunol. 44 (7), 2188-2191 (2014).
- Sun, J., et al. A broad-range of recombination cloning vectors in mycobacteria. Plasmid. 62 (3), 158-165 (2009).
- Laitinen, O. H., et al. Rational design of an active avidin monomer. J. Biol. Chem. 278 (6), 4010-4014 (2003).
- Flynn, J. L., Chan, J., Triebold, K. J., Dalton, D. K., Stewart, T. A., Bloom, B. R. An essential role for interferon gamma in resistance to Mycobacterium tuberculosis infection. J Exp Med. 178 (6), 2249-2254 (1993).
- Liao, T. Y. A., Lau, A., Joseph, S., Hytonen, V., Hmama, Z. Improving the immunogenicity of the Mycobacterium bovis BCG vaccine by non-genetic bacterial surface decoration using the avidin-biotin system. PLoS ONE. 10 (12), e0145833 (2015).
- Green, N. M. Avidin and streptavidin. Methods Enzymol. 184, 51-67 (1990).
- Howarth, M., Takao, K., Hayashi, Y., Ting, A. Y. Targeting quantum dots to surface proteins in living cells with biotin ligase. PNAS. 102 (21), 7583-7588 (2005).
- Lesch, H. P., Kaikkonen, M. U., Pikkarainen, J. T., Yla-Herttuala, S. Avidin-biotin technology in targeted therapy. Expert Opin Drug Deliv. 7 (5), 551-564 (2010).
- Paganelli, G., Bartolomei, M., Grana, C., Ferrari, M., Rocca, P., Chinol, M. Radioimmunotherapy of brain tumor. Neurol Res. 28 (5), 518-522 (2006).
- Cummings, J. F., et al. Safety and immunogenicity of a plant-produced recombinant monomer hemagglutinin-based influenza vaccine derived from influenza A (H1N1)pdm09 virus: a Phase 1 dose-escalation study in healthy adults. Vaccine. 32 (19), 2251-2259 (2014).
- Kolotilin, I., et al. Plant-based solutions for veterinary immunotherapeutics and prophylactics. Vet Res. 45, 114-117 (2014).
- Demonte, D., Drake, E. J., Lim, K. H., Gulick, A. M., Park, S. Structure-based engineering of streptavidin monomer with a reduced biotin dissociation rate. Proteins. 81 (9), 1621-1633 (2013).
- Deghmane, A. E., et al. Lipoamide dehydrogenase mediates retention of coronin-1 on BCG vacuoles, leading to arrest in phagosome maturation. J Cell Sci. 120 (19), 3489-3489 (2007).
- Soualhine, H., et al. Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin secreting active cathepsin S stimulates expression of mature MHC class II molecules and antigen presentation in human macrophages. J Immunol. 179 (8), 5137-5145 (2007).
- Bubb, M. O., Green, F., Conradie, J. D., Tchernyshev, B., Bayer, E. A., Wilchek, M. Natural antibodies to avidin in human serum. ImmunolLett. 35 (3), 277-280 (1993).
- Petronzelli, F., et al. Therapeutic use of avidin is not hampered by antiavidin antibodies in humans. Cancer Biother Radiopharm. 25 (5), 563-570 (2010).
- Bigini, P., et al. In vivo fate of avidin-nucleic acid nanoassemblies as multifunctional diagnostic tools. ACS Nano. 8 (1), 175-187 (2014).
