Expression des antigènes exogènes dans le Mycobacterium bovis BCG par l’intermédiaire de décoration de Surface Non génétiques avec le système avidine-biotine
Summary
Une nouvelle technique pour l’affichage rapide de l’antigène sur la surface bactérienne est présente, ce qui implique biotinylation surface suivie d’une exposition à des protéines d’intérêt en fusion avec avidine monomère. Chargement de BCG avec certains antigènes avec succès améliore son immunogénicité, suggérant que la décoration de surfaces peut remplacer les approches génétiques traditionnelles.
Abstract
La tuberculose est une maladie infectieuse grave et le bacille de M. bovis de vaccin disponible uniquement Calmette-Guérin (BCG) est sûr et efficace pour la protection contre la méningite tuberculeuse grave de l’enfant et de certaines formes de tuberculose disséminée, mais ne parvient pas à protéger contre la tuberculose pulmonaire, qui est la forme la plus répandue de la maladie. Des stratégies prometteuses pour améliorer le BCG actuellement fonder soit sur sa transformation avec gènes codant immunodominant M. tuberculosis (Mtb)-antigènes spécifiques et/ou de complémentation avec des gènes codant des co-facteurs qui stimuleraient l’antigène cellules présentatrices. Les principales limites de ces approches incluent faible efficacité et faible stabilité au niveau incertain de sûreté des vecteurs d’expression. Dans cette étude, nous présentons une approche alternative à l’amélioration de vaccin, qui se compose de complémentation de BCG avec des protéines exogènes d’intérêt sur la surface des bactéries, plutôt que de transformation avec des plasmides codant des gènes correspondants. Tout d’abord, les protéines d’intérêt sont exprimées en fusion avec avidine monomère dans la norme d’e. coli des systèmes d’expression, puis utilisée pour décorer la surface de biotinylé BCG. L’expérimentation animale utilisant BCG surface ornée d’antigène de l’ovalbumine substitut démontre que la bactérie modifiée est immunogène et capables d’induire des lymphocytes T spécifiques. Au total, les données présentées ici fortement appuient un roman et une méthode efficace pour remodeler le vaccin BCG actuel qui remplace l’approche conventionnelle laborieux de complémentation avec des acides nucléiques exogènes.
Introduction
Diverses stratégies ont été proposées pour remplacer l’actuel TB vaccin BCG, y compris les protéines adjuvant systèmes, technologies vectorisées virales, souches vivantes atténuées de tuberculosis et des souches de BCG génétiquement modifiées, soit pour introduire des gènes surexprimant les antigènes BCG qui ne sont pas suffisamment exprimées au cours de l’infection1 ou VTT-antigènes spécifiques non présent dans le BCG2. Génie génétique, cependant, est confrontée à de nombreux obstacles y compris le niveau incertain de la sécurité, le processus fastidieux et la faible efficacité de vecteurs d’expression,4,5. En ce qui concerne l’amélioration de BCG, une autre approche est nécessaire pour améliorer l’immunogénicité sans la nécessité d’alternances génétiques incertains.
Dans cette étude, nous introduisons une nouvelle stratégie pour l’affichage des protéines recombinantes d’intérêt sur la surface des cellules par le BCG qui repose sur l’interaction de l’avidine bien connue de haute affinité avec de la biotine. Cette approche permet une fixation rapide et reproductible des protéines de fusion recombinantes avidine sur la surface de biotinylé BCG, ce qui facilite les manipulations larges de BCG à réaliser une amélioration maximale de son efficacité tout en conservant son excellente sécurité enregistrer, observé au cours des décennies d’utilisation.
L’avidine affinité pour la biotine est extrêmement élevée (Kd = 10−15 M) et une fois formé, le complexe biotine-avidine est très stable et peut seulement être perturbé sous dénaturer des conditions6. Toutefois, pour ce type d’interaction pour servir comme une alternative de méthode de transfert de gène, affichage à long terme mais réversible de protéines recombinantes est requise. Ainsi, nous avons introduit ici une avidine monomère de faible affinité (Kd = 10−7 M) que mène à la libération réversible de protéines de la surface décorée BCG ingéré une fois à l’intérieur de cellules présentatrices. Afin de fournir une preuve de concept, nous avons testé cette méthode en utilisant une protéine chimérique avidine monomère correspondant à un antigène de substitution provenant d’ovalbumine (OVA)7,8. Les résultats ont montré que la surface des cellules par le BCG peut être facilement et rapidement décorée avec des protéines de fusion avidine monomère et que cette liaison à la surface du BCG est stable et reproductible sans changement détectable à la survie et la croissance bactérienne. En outre, nous avons constaté que BCG orné de monomère avidine fusionnée avec des ovules (AviOVA) peut induire une réponse immunitaire semblable à celle induite par le BCG génétiquement exprimant l’antigène même in vitro et in vivo. Cette technologie d’affichage réversible de protéines d’intérêt sur la surface bactérienne est donc un remplacement efficace des approches de transfert de gène traditionnel et peut fournir une plate-forme pour les grandes manipulations du BCG et de nouvelles demandes en vaccin développement.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons rapporté dans cette étude une approche non génétiques pour un affichage rapide et efficace des protéines exogènes sur surface de BCG pour ajouter des antigènes spécifiques ou des propriétés fonctionnelles spécifiques censées améliorer efficacement l’immunogénicité de la bactérie. Nous avons démontré que la surface des cellules BCG pourrait être facilement biotinylé pour la décoration de surface instantanée avec des protéines de fusion de l’avidine. La procédure totale peut être eff…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr R Stokes pour la souche de BCG Pasteur et A. Talal pour le support technique. Nous remercions également GenScript pour aide à la synthèse de gènes.
Materials
| Endotoxin-free RPMI 1640 | StemCell Technologies | 36750 | |
| Sulfo-NHS SS biotin | Thermo Fisher | 21328 | |
| FITC-conjugated streptavidin | Sigma-Aldrich | S3762 | |
| Phycoerythrin (PE)-conjugated I-Ab-OVA323-339 tetramer | MBL International | TS-M710-1 | |
| 7-AAD | BD Pharmingen | 559925 | |
| TALON polyhistidine-Tag purification resin | Clontech | 635501 | |
| Alexa Fluor (AF) 647 conjugated rat anti-mouse CD4 | BD Bioscience | 557681 | |
| AF647 rat anti-mouse IFN-g | BD Bioscience | 557735 | |
| AF647 rat anti-mouse I-A/I-E | BD Bioscience | 562367 | |
| PeCy7 rat anti-mouse CD4 | BD Bioscience | 552775 | |
| PE rat anti-mouse CD8 Ab | BD Bioscience | 561095 | |
| AF 647 rat anti-mouse H-2kb | BD Bioscience | 562832 | |
| FITC-conjugated goat anti rabbit antibody | Thermo Fisher | 31635 | |
| AF 647 rat anti-mouse CD4 | BD Bioscience | 557681 | |
| Ultra-small gold-conjugated goat anti-rabbit IgG | Electron Microscopy Sciences | 25100 | |
| Middlebrook 7H9 broth | BD Diagnostic Systems | 271310 | |
| OADC | BD Diagnostic Systems | B11886 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| RAW 264.7 murine macrophage cell lines | American Type Culture Collection | ||
| pDEST17 plasmid | Invitrogen | 11803012 | |
| pUC57-OVA plasmid | GenScript | SD1176 | |
| BP clonase | Invitrogen | 11789020 | |
| LR clonase | Invitrogen | 11791043 | |
| pDONR221 plasmid | Invitrogen | 12536017 | |
| Ni-NTA columns | Qiagen | 31014 | |
| Pierce protein concentrators | Thermo Fisher | 88527 | |
| Flurosave | Calbiochem-Novabiochem | 345789 | |
| Axioplan II epifluorescence microscope | Carl Zeiss Inc | ||
| CCD digital camera | Retiga EX, QImaging | ||
| Tecnai G2 200kV electron microscope | FEI Company | G2 200Kv | |
| 70μm Falcon cell strainer | Thermo Fisher | 87712 | |
| EasyStep mouse biotin positive selection kit | StemCell | 18556 | |
| biotin-Ter119/Ertyroid cells antibody | BioLegend | 116203 | |
| Brefeldin A | BD Pharmingen | 555029 | |
| Cytofix/Cytoperm kit | BD Pharmingen | 554714 | |
| Bright-Glo Luciferase assay system | Promega | e2620 | |
| Turner Biosystem luminometer | Promega | TD-20/20 | |
| Leica EM UC6 microtome | Leica Microsystems | UC6 | |
| Novalyphe NL 500 freeze dryer | Savant Instruments | NL 50 | |
| Wheaton boroscilicate glass vials | Wheaton | VWR 66011-675 |
References
- Horwitz, M. A., Harth, G. A new vaccine against tuberculosis affords greater survival after challenge than the current vaccine in the guinea pig model of pulmonary tuberculosis. Infect. Immun. 71 (4), 1672-1679 (2003).
- Pym, A. S., et al. Recombinant BCG exporting ESAT-6 confers enhanced protection against tuberculosis. Nat Med. 9 (5), 548-553 (2003).
- Grode, L., et al. Increased vaccine efficacy against tuberculosis of recombinant Mycobacterium bovis bacille Calmette-Guerin mutants that secrete listeriolysin. The J Clin Invest. 115 (9), 2472-2479 (2005).
- Bastos, R. G., Borsuk, S., Seixas, F. K., Dellagostin, O. A. Recombinant Mycobacterium bovis BCG. Vaccine. 27 (47), 6495-6503 (2009).
- Mederle, I., et al. Plasmidic versus insertional cloning of heterologous genes in Mycobacterium bovis BCG: impact on in vivo antigen persistence and immune responses. Infect Immun. 70 (1), 303-314 (2002).
- Singh, N. P., et al. A Novel Approach to Cancer Immunotherapy Tumor Cells Decorated with CD80 Generate Effective Antitumor Immunity A Novel Approach to Cancer Immunotherapy Tumor Cells Decorated with CD80 Generate Effective Antitumor Immunity. Cancer Res. 63 (14), 4067-4073 (2003).
- Oizumi, S., Strbo, N., Pahwa, S., Deyev, V., Podack, E. R. Molecular and cellular requirements for enhanced antigen cross-presentation to CD8 cytotoxic T lymphocytes. J Immunol. 179 (4), 2310-2317 (2007).
- Sharif-Paghaleh, E., et al. Monitoring the efficacy of dendritic cell vaccination by early detection of (99m) Tc-HMPAO-labelled CD4(+) T cells. Eur J Immunol. 44 (7), 2188-2191 (2014).
- Sun, J., et al. A broad-range of recombination cloning vectors in mycobacteria. Plasmid. 62 (3), 158-165 (2009).
- Laitinen, O. H., et al. Rational design of an active avidin monomer. J. Biol. Chem. 278 (6), 4010-4014 (2003).
- Flynn, J. L., Chan, J., Triebold, K. J., Dalton, D. K., Stewart, T. A., Bloom, B. R. An essential role for interferon gamma in resistance to Mycobacterium tuberculosis infection. J Exp Med. 178 (6), 2249-2254 (1993).
- Liao, T. Y. A., Lau, A., Joseph, S., Hytonen, V., Hmama, Z. Improving the immunogenicity of the Mycobacterium bovis BCG vaccine by non-genetic bacterial surface decoration using the avidin-biotin system. PLoS ONE. 10 (12), e0145833 (2015).
- Green, N. M. Avidin and streptavidin. Methods Enzymol. 184, 51-67 (1990).
- Howarth, M., Takao, K., Hayashi, Y., Ting, A. Y. Targeting quantum dots to surface proteins in living cells with biotin ligase. PNAS. 102 (21), 7583-7588 (2005).
- Lesch, H. P., Kaikkonen, M. U., Pikkarainen, J. T., Yla-Herttuala, S. Avidin-biotin technology in targeted therapy. Expert Opin Drug Deliv. 7 (5), 551-564 (2010).
- Paganelli, G., Bartolomei, M., Grana, C., Ferrari, M., Rocca, P., Chinol, M. Radioimmunotherapy of brain tumor. Neurol Res. 28 (5), 518-522 (2006).
- Cummings, J. F., et al. Safety and immunogenicity of a plant-produced recombinant monomer hemagglutinin-based influenza vaccine derived from influenza A (H1N1)pdm09 virus: a Phase 1 dose-escalation study in healthy adults. Vaccine. 32 (19), 2251-2259 (2014).
- Kolotilin, I., et al. Plant-based solutions for veterinary immunotherapeutics and prophylactics. Vet Res. 45, 114-117 (2014).
- Demonte, D., Drake, E. J., Lim, K. H., Gulick, A. M., Park, S. Structure-based engineering of streptavidin monomer with a reduced biotin dissociation rate. Proteins. 81 (9), 1621-1633 (2013).
- Deghmane, A. E., et al. Lipoamide dehydrogenase mediates retention of coronin-1 on BCG vacuoles, leading to arrest in phagosome maturation. J Cell Sci. 120 (19), 3489-3489 (2007).
- Soualhine, H., et al. Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin secreting active cathepsin S stimulates expression of mature MHC class II molecules and antigen presentation in human macrophages. J Immunol. 179 (8), 5137-5145 (2007).
- Bubb, M. O., Green, F., Conradie, J. D., Tchernyshev, B., Bayer, E. A., Wilchek, M. Natural antibodies to avidin in human serum. ImmunolLett. 35 (3), 277-280 (1993).
- Petronzelli, F., et al. Therapeutic use of avidin is not hampered by antiavidin antibodies in humans. Cancer Biother Radiopharm. 25 (5), 563-570 (2010).
- Bigini, P., et al. In vivo fate of avidin-nucleic acid nanoassemblies as multifunctional diagnostic tools. ACS Nano. 8 (1), 175-187 (2014).
