İnsan kalp dokusu hücre dışı matriks hidrojel Vitro ve In Vivo uygulamaları için kendi kendine montaj doğru işlenmesi
Summary
Bu iletişim kuralı tam decellularization insan Miyokardiyum, hücre dışı matriks bileşenlerinin koruma sırasında açıklar. Microparticles ve cytoprotective kendi kendine montaj hidrojel üretiminde hücre dışı matriks sonuçlarının daha fazla alay.
Abstract
Acellular hücre dışı matriks ürünleri hücre-matris etkileşimleri eğitimi için yararlıdır ve rejeneratif hücre terapisi uygulamaları kolaylaştırmak. Birçok ticari hücre dışı matriks ürün hydrogels veya membranlar olarak kullanılabilir, ancak bunlar doku özgü biyolojik aktivitesi sahip değilsin. Perfüzyon decellularization genellikle insan kalp dokusu ile mümkün olmadığı için 3-adım daldırma decellularization süreci geliştirdik. Ameliyat sırasında tedarik insan miyokardiyal dilimleri ilk deterjan-Alerjik hiperozmolar lizis arabellek, iyonik deterjan, Sodyum Lauryl Sülfat ile kuluçka takip ile tedavi ve içsel Dnaz aktivitesini sömürerek tamamlanmıştır Fetal sığır serum. Bu teknik boş hücre yaprak kalp hücre dışı matriks ile büyük ölçüde fibröz doku mimarisi ve biyopolimer kompozisyon, korunmuş olan kardiyak hücre popülasyonlarının ve pluripotent kök için belirli çevre yardım sağlamak için gösterildi sonuçlanır hücreleri. Kardiyak hücre dışı matriks sayfaları daha sonra daha da daha fazla kimyasal değişiklik yapmadan bir microparticle toz içine işlenmiş veya, bir kendi kendine montaj kardiyak hücre dışı matriks hidrojel ile içine kısa vadeli pepsin sindirim yolu ile korunmuş bioactivity.
Introduction
Hücre dışı Matriks (ECM) sadece yapısal destek ama aynı zamanda biyolojik hücre için önemlidir ve doku1işlev sağlar. Kalbinden, fibrozis, iltihap, anjiogenez, cardiomyocyte contractile fonksiyon ve canlılığı ve ikamet progenitör hücre kader gibi Etyopatogenezi yanıt Yönetmeliği ECM katılmaktadır. Birincil bileşenleri ek olarak – lifli glikoproteinlerin, glikozaminoglikan ve Proteoglikanlar – salgılanan büyüme faktörleri, sitokinler ve membranöz veziküller2,3nükleik asitler ve protein içeren bir dizi içerir.
Son zamanlarda acellular ECM hazırlıkları sadece hücre-matris etkileşimleri, potansiyel terapötik hücre tabanlı uygulamalar için de eğitim için çok değerli değildir açık hale gelmiştir. Tedavi hücre ürünlere veya mühendislik dokulara yeterli bir ortam önemini şimdi yaygın kabul edilmektedir. Girişimleri hücre süspansiyonlar veya aktif bileşikler ile tanımlanan biopolymeric hydrogels4,5,6 veya protein kokteyller (Yani, Matrigel, Geltrex) fare sarkomu hücreleri tarafından salgılanan birleştirmek için yapılmıştır 7. ancak, eski bioactivity sınırlı, ikinci GMP-grade süreçlerinde sorunlu ve her ikisi de kalp ECM (cECM)8,9,10, doku özgü bioactivity eksikliği 11,12,13.
Miyokardiyum decellularization daha önce bütün kalp koroner damarlara14,15ile perfüzyon tarafından yapıldı. Bu hayvan kalbimizde mümkün olmakla birlikte, sağlam insan kalpleri nadiren mevcuttur. Bu nedenle, ameliyat odasında alınan doku örnekleri işlemek için izin veren bir daldırma işlemi tercih. Bizim “3-adım” Protokolü 3 ayrı içerir kuluçka Yani lizis, solubilization ve DNA kaldırma adımlarını. Büyük ölçüde korunmuş protein ve glikozaminoglikan kompozisyon16,ile17insan miyokardiyal ECM verimleri. Bu cECM dilimler hücre-matris etkileşimlerin vitro çalışmalar için izin ancak kötü potansiyel insan ölçekli tedavi uygulamaları için uygundur. Üretim sürecinin ardından liyofilize cECM microparticles ya da cECM hidrojel18üretmek için uzatıldı.
Bu iletişim kuralı insan Miyokardiyum miyokard hücre dışı Matriks (ECM) ve biyolojik faaliyetlerini önemli bileşenleri koruyarak cerrahi örneklerinden elde decellularization için izin verir. Bu iletişim kuralı ile korunmuş doku özgü bioactivity insan kalp ECM hücre-matris etkileşimleri deneysel çalışmalar için gerekli olduğunda veya makul bir ortam miyokardiyal rejenerasyon hücre tabanlı yaklaşımlar için gerektiğinde önerilir. İşlenmiş cECM kullanımı mümkün gelecekte tedavi uygulamaları olmalıdır böylece prensipte, bu protokol GMP-sınıf koşullarına, adapte mümkündür.
Protocol
Representative Results
Discussion
İnsan miyokardiyal ECM hazırlarken aşağıdaki ulaşmak hedeftir: kaldırma ilgili immünojenik hücresel malzemeleri, ECM bütünlüğü ve bioactivity, kısırlık, toksisitesi son ürünü, GMP-işlem uyumluluk, korunması ve ürün işleme açısından belirli bir uygulama için uygunluğunu. Bizim 3-adım decellularization protokol microparticles veya kendi kendine montaj hidrojel işleme daha fazla ile birleştirerek, insan kalp ECM malzeme elde edilir belirli biyolojik aktivitesi sahip, işlemek kolay ve için …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Çalışma Protokolü Helsinki Bildirgesi içinde özetlenen etik ilkelere uyan. Hasta Onam doku kullanımı araştırma amacıyla için sağlanan ve doku toplama sürecinin kurumsal Değerlendirme Komitesi ve Charité – Universitätsmedizin Berlin (EA4/028/12) Etik Komitesi tarafından kabul edildi.
Materials
| Balance | DR Precisa, Dietikon, Switzerland | Precisa XR 205SM | |
| Blades Nr.10 Skalpell Nr.3 | InstrumenteNRW, Erftstadt, Germany | SK-10-004 | |
| Cell culture plates (6-well) | Greiner, Frickenhausen, Germany | 657160 | |
| Cryostat CM | Leica, Wetzlar, Germany | 3050S | |
| EDTA | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8043.3 | |
| Eppendorf reaction tubes (1.5 or 2 ml) | Greiner, Frickenhausen, Germany | 616201, 623201 | |
| Falcon 15ml, 50ml | Greiner, Frickenhausen, Germany | 188271, 227270 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrome, Berlin, Germany | S 0115 | |
| Freeze Dry System | Labconco, Kansas City, USA | 7670520 | |
| Freezer (-80°C) | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | Forma 900 Series | |
| HCl | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 281.1 | |
| Microtome Blades Type 819 | Leica, Wetzlar, Germany | 14035838925 | |
| Minilys Homogeniser | PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Germany | 91-PCSM | |
| NaOH | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | K021.1 | |
| Nystatin | PAN Biotech, Aidenbach, Germany | P06-07800 | |
| PBS | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | 14190-094 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies, Darmstadt, Germany | 15140122 | |
| Pepsin | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | P6887-1G | |
| Precellys Keramik-Kit 1.4 mm | Peqlab Biotechnolgie, Erlangen, Germany | 91-PCS-CK14 | |
| Rotamax 120 Plate shaker | Heidolph, Schwabach, Germany | 544-41200-00 | |
| SDS | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | CN30.3 | |
| Stereo microscope | Leica, Wetzlar, Germany | M125 | |
| Steriflip-GP, 0,22 µm | Merck Millipore, Darmstadt, Germany | SCGP00525 | |
| Stuart analogue rocker & roller mixers | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | Z675113-1EA | |
| Tissue Tek O.C.T compound | Hartenstein, Wurzburg, Germany | TTEK | |
| Transfusion set 200µm | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 798.200.500 | |
| TRIS | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 5429.3 | |
| vedena Skalpellgriff Fig. 3, Standard, 125 mm | Medical Highlights, Rohrdorf, Germany | CV102-003 | |
| Vortex-Genie2 | Scientific Industry, New York, USA | SI-0256 |
References
- Elliott, R., Hoehn, J. Use of Commercial Porcine Skin for Wound Dressings. Plastic and reconstructive surgery. 52 (4), 401-405 (1973).
- Rienks, M., Papageorgiou, A. -. P., Frangogiannis, N. G., Heymans, S. Myocardial Extracellular Matrix: An Ever-Changing and Diverse Entity. Circulation Research. 114 (5), 872-888 (2014).
- Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction. Circulation Research. 119 (1), 91-112 (2016).
- Boopathy, A. V., Martinez, M. D., Smith, A. W., Brown, M. E., Garcia, A. J., Davis, M. Intramyocardial Delivery of Notch Ligand-Containing Hydrogels Improves Cardiac Function and Angiogenesis Following Infarction. Tissue Eng Part A. 21 (17-18), 2315-2322 (2015).
- Gaetani, R., Yin, C., et al. Cardiac derived extracellular matrix enhances cardiogenic properties of human cardiac progenitor cells. Cell Transplant. , (2015).
- Kraehenbuehl, T. P., Ferreira, L. S., et al. Human embryonic stem cell-derived microvascular grafts for cardiac tissue preservation after myocardial infarction. Biomaterials. 32 (4), 1102-1109 (2011).
- Zhang, J., Klos, M., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: The matrix sandwich method. Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).
- Fong, A. H., Romero-López, M., et al. Three-Dimensional Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Maturation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Tissue Engineering Part A. 22 (15-16), 1016-1025 (2016).
- DeQuach, J. A., Mezzano, V., et al. Simple and High Yielding Method for Preparing Tissue Specific Extracellular Matrix Coatings for Cell Culture. PLoS ONE. 5 (9), e13039 (2010).
- Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function. Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).
- Tukmachev, D., Forostyak, S., et al. Injectable extracellular matrix hydrogels as scaffolds for spinal cord injury repair. Tissue Eng Part A. , (2016).
- Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix. Biomaterials. 29 (11), 1630-1637 (2008).
- Singelyn, J. M., Sundaramurthy, P., et al. Catheter-deliverable hydrogel derived from decellularized ventricular extracellular matrix increases endogenous cardiomyocytes and preserves cardiac function post-myocardial infarction. Journal of the American College of Cardiology. 59 (8), 751-763 (2012).
- Wainwright, J. M., Czajka, C. A., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart. Tissue Eng Part C Methods. 16 (3), 525-532 (2010).
- Ott, H. C., Matthiesen, T. S., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).
- Oberwallner, B., Anic, B. A., et al. Human cardiac extracellular matrix supports myocardial lineage commitment of pluripotent stem cells. Eur J Cardiothorac Surg. 47, 416-425 (2015).
- Oberwallner, B., Brodarac, A., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix scaffolds by decellularization of human myocardium. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102 (9), 3263-3272 (2014).
- Kappler, B., Anic, P., et al. The cytoprotective capacity of processed human cardiac extracellular matrix. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. , (2016).
- Bashey, R. I., Martinez-Hernandez, A., Jimenez, S. A. Isolation, characterization, and localization of cardiac collagen type VI. Associations with other extracellular matrix components. Circulation Research. 70 (5), (1992).
- Wu, J., Ravikumar, P., Nguyen, K. T., Hsia, C. C. W., Hong, Y., Gorler, A. Lung protection by inhalation of exogenous solubilized extracellular matrix. PLOS ONE. 12 (2), e0171165 (2017).
- Chen, W. C. W., Wang, Z., et al. Decellularized zebrafish cardiac extracellular matrix induces mammalian heart regeneration. Science Advances. 2 (11), e1600844 (2016).
- Godier-Furnémont, A. F. G., Martens, T. P., et al. Composite scaffold provides a cell delivery platform for cardiovascular repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7974-7979 (2011).
- Sarig, U., Sarig, H., et al. Natural myocardial ECM patch drives cardiac progenitor based restoration even after scarring. Acta Biomaterialia. 44, 209-220 (2016).
- Singelyn, J. M., DeQuach, J. A., Seif-Naraghi, S. B., Littlefield, R. B., Schup-Magoffin, P. J., Christman, K. L. Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering. Biomaterials. 30 (29), 5409-5416 (2009).
