Procesamiento de tejido cardiaco humano hacia la matriz extracelular autoensamblada hidrogel para aplicaciones In Vivo y In Vitro
Summary
Este protocolo describe la descelularización completa del miocardio humano conservando sus componentes de matriz extracelular. Tratamiento posterior de los resultados de la matriz extracelular en la producción de micropartículas y un hidrogel de uno mismo-montaje de citoprotectores.
Abstract
Preparación de la matriz extracelular acelular es útiles para estudiar las interacciones célula-matriz y facilitar las aplicaciones de la terapia celular regenerativa. Varios productos comerciales matriz extracelular están disponibles como hidrogeles o membranas, pero estas no poseen actividad biológica específica de tejido. Porque descelularización de perfusión no es generalmente posible con tejido cardíaco humano, desarrollamos un proceso de descelularización de inmersión de 3 pasos. Rebanadas miocardio humanos adquiridos durante la cirugía se tratan primero con tampón de lisis hiperosmolar libre de detergente, seguido por la incubación con lo iónicos detergente, dodecil sulfato de sodio, y el proceso se completa mediante la explotación de la actividad de la ADNasa intrínseca de suero bovino fetal. Esta técnica resulta en hojas sin células de la matriz extracelular cardiaca con conserva en gran parte tejido fibroso arquitectura y Biopolímeros composición, que fueron demostradas para proporcionar señales ambientales específicos a poblaciones de la célula cardiaca y vástago de pluripotent células. Hojas de matriz extracelular cardiaca pueden entonces más procesadas en un polvo de micropartículas sin mayor modificación química, o, mediante digestión de pepsina a corto plazo, en un hidrogel uno mismo-montaje de la matriz extracelular cardiaca con conserva bioactividad.
Introduction
La matriz extracelular (ECM) proporciona no sólo estructural de apoyo pero también es importante para la célula biológica y función de tejidos1. En el corazón, el ECM participa en la regulación de las respuestas fisiopatológicas tales como fibrosis, inflamación, angiogénesis, función contráctil del cardiomiocito y viabilidad y destino de la célula del progenitor residente. Además de sus principales componentes fibrosos glicoproteínas, glicosaminoglicanos y proteoglicanos – contiene una serie de vesículas membranosas que contienen ácidos nucleicos y proteínas2,3, secretadas factores de crecimiento y citoquinas.
Recientemente ha quedado claro que preparados acelulares de ECM no sólo son inestimables para el estudio de las interacciones célula-matriz, sino también para posibles aplicaciones terapéuticas basadas en células. Ahora es ampliamente reconocida la importancia de proporcionar un entorno adecuado para productos celulares terapéuticos o ingeniería de tejidos. Ha habido intentos para combinar suspensiones celulares o compuestos activos con hidrogeles biopolímeros definido4,5,6 o con cócteles de proteína secretadas por las células del sarcoma murino (es decir, Matrigel, Geltrex) 7. sin embargo, los primeros son limitadas bioactividad, estos últimos son problemáticos en los procesos de calidad GMP y ambos carecen de la bioactividad específica de tejido cardiaco ECM (cECM)8,9,10, 11,12,13.
Descelularización del miocardio se ha realizado previamente por la perfusión del corazón entero a través de la vasculatura coronaria14,15. Mientras que esto es posible en animales corazones, corazones humanos intactos están raramente disponibles. Por lo tanto, fue favorecido un proceso de inmersión que permite la manipulación de las muestras de tejido obtenidas en la sala de operaciones. Nuestro protocolo “3 pasos” contiene 3 separado incubación pasos a saber: lisis, solubilización y extracción de ADN. Produce la ECM miocardio humana con en gran parte conservadas proteínas y glicosaminoglicanos composición16,17. Estas rebanadas cECM permiten estudios en vitro de las interacciones célula-matriz pero están mal adaptados para posibles aplicaciones terapéuticas de la escala humana. El proceso de fabricación se amplió entonces para producir micropartículas cECM liofilizado o un hidrogel cECM del18.
Este protocolo permite la descelularización de miocardio humano Obtenido de muestras quirúrgicas, preservación de los componentes principales de la matriz extracelular miocárdica (ECM) y su actividad biológica. Este protocolo se recomienda cuando ECM cardiaca humana con bioactividad específica de tejido conservada se requiere para estudios experimentales de las interacciones célula-matriz, o cuando se necesita un ambiente adecuado para regeneración miocárdica celular enfoques. En principio, también es posible adaptar este protocolo a las condiciones GMP-grado, para que el uso del cECM procesado debería ser factibles aplicaciones terapéuticas en el futuro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Al preparar el ECM miocardio humano, el objetivo es lograr lo siguiente: retiro de material celular inmunógenos relevante, preservación de la integridad de la ECM y bioactividad, esterilidad, no toxicidad del producto final, compatibilidad de procesos GMP, y idoneidad del producto para una aplicación determinada en términos de manejo. Combinando nuestro protocolo de descelularización de 3 pasos con tratamiento posterior en micropartículas o uno mismo-montaje de hidrogel, material humano de ECM cardiaca se obtiene q…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El protocolo de estudio se ajusta a los principios éticos descritos en la declaración de Helsinki. Pacientes siempre el consentimiento informado para el uso del tejido para fines de investigación, y el proceso de recogida de tejido fue aprobado por la Junta de revisión institucional y Comité de ética de Charité – Universitätsmedizin Berlín (EA4/028/12).
Materials
| Balance | DR Precisa, Dietikon, Switzerland | Precisa XR 205SM | |
| Blades Nr.10 Skalpell Nr.3 | InstrumenteNRW, Erftstadt, Germany | SK-10-004 | |
| Cell culture plates (6-well) | Greiner, Frickenhausen, Germany | 657160 | |
| Cryostat CM | Leica, Wetzlar, Germany | 3050S | |
| EDTA | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8043.3 | |
| Eppendorf reaction tubes (1.5 or 2 ml) | Greiner, Frickenhausen, Germany | 616201, 623201 | |
| Falcon 15ml, 50ml | Greiner, Frickenhausen, Germany | 188271, 227270 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrome, Berlin, Germany | S 0115 | |
| Freeze Dry System | Labconco, Kansas City, USA | 7670520 | |
| Freezer (-80°C) | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | Forma 900 Series | |
| HCl | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 281.1 | |
| Microtome Blades Type 819 | Leica, Wetzlar, Germany | 14035838925 | |
| Minilys Homogeniser | PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Germany | 91-PCSM | |
| NaOH | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | K021.1 | |
| Nystatin | PAN Biotech, Aidenbach, Germany | P06-07800 | |
| PBS | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | 14190-094 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies, Darmstadt, Germany | 15140122 | |
| Pepsin | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | P6887-1G | |
| Precellys Keramik-Kit 1.4 mm | Peqlab Biotechnolgie, Erlangen, Germany | 91-PCS-CK14 | |
| Rotamax 120 Plate shaker | Heidolph, Schwabach, Germany | 544-41200-00 | |
| SDS | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | CN30.3 | |
| Stereo microscope | Leica, Wetzlar, Germany | M125 | |
| Steriflip-GP, 0,22 µm | Merck Millipore, Darmstadt, Germany | SCGP00525 | |
| Stuart analogue rocker & roller mixers | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | Z675113-1EA | |
| Tissue Tek O.C.T compound | Hartenstein, Wurzburg, Germany | TTEK | |
| Transfusion set 200µm | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 798.200.500 | |
| TRIS | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 5429.3 | |
| vedena Skalpellgriff Fig. 3, Standard, 125 mm | Medical Highlights, Rohrdorf, Germany | CV102-003 | |
| Vortex-Genie2 | Scientific Industry, New York, USA | SI-0256 |
References
- Elliott, R., Hoehn, J. Use of Commercial Porcine Skin for Wound Dressings. Plastic and reconstructive surgery. 52 (4), 401-405 (1973).
- Rienks, M., Papageorgiou, A. -. P., Frangogiannis, N. G., Heymans, S. Myocardial Extracellular Matrix: An Ever-Changing and Diverse Entity. Circulation Research. 114 (5), 872-888 (2014).
- Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction. Circulation Research. 119 (1), 91-112 (2016).
- Boopathy, A. V., Martinez, M. D., Smith, A. W., Brown, M. E., Garcia, A. J., Davis, M. Intramyocardial Delivery of Notch Ligand-Containing Hydrogels Improves Cardiac Function and Angiogenesis Following Infarction. Tissue Eng Part A. 21 (17-18), 2315-2322 (2015).
- Gaetani, R., Yin, C., et al. Cardiac derived extracellular matrix enhances cardiogenic properties of human cardiac progenitor cells. Cell Transplant. , (2015).
- Kraehenbuehl, T. P., Ferreira, L. S., et al. Human embryonic stem cell-derived microvascular grafts for cardiac tissue preservation after myocardial infarction. Biomaterials. 32 (4), 1102-1109 (2011).
- Zhang, J., Klos, M., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: The matrix sandwich method. Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).
- Fong, A. H., Romero-López, M., et al. Three-Dimensional Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Maturation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Tissue Engineering Part A. 22 (15-16), 1016-1025 (2016).
- DeQuach, J. A., Mezzano, V., et al. Simple and High Yielding Method for Preparing Tissue Specific Extracellular Matrix Coatings for Cell Culture. PLoS ONE. 5 (9), e13039 (2010).
- Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function. Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).
- Tukmachev, D., Forostyak, S., et al. Injectable extracellular matrix hydrogels as scaffolds for spinal cord injury repair. Tissue Eng Part A. , (2016).
- Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix. Biomaterials. 29 (11), 1630-1637 (2008).
- Singelyn, J. M., Sundaramurthy, P., et al. Catheter-deliverable hydrogel derived from decellularized ventricular extracellular matrix increases endogenous cardiomyocytes and preserves cardiac function post-myocardial infarction. Journal of the American College of Cardiology. 59 (8), 751-763 (2012).
- Wainwright, J. M., Czajka, C. A., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart. Tissue Eng Part C Methods. 16 (3), 525-532 (2010).
- Ott, H. C., Matthiesen, T. S., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).
- Oberwallner, B., Anic, B. A., et al. Human cardiac extracellular matrix supports myocardial lineage commitment of pluripotent stem cells. Eur J Cardiothorac Surg. 47, 416-425 (2015).
- Oberwallner, B., Brodarac, A., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix scaffolds by decellularization of human myocardium. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102 (9), 3263-3272 (2014).
- Kappler, B., Anic, P., et al. The cytoprotective capacity of processed human cardiac extracellular matrix. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. , (2016).
- Bashey, R. I., Martinez-Hernandez, A., Jimenez, S. A. Isolation, characterization, and localization of cardiac collagen type VI. Associations with other extracellular matrix components. Circulation Research. 70 (5), (1992).
- Wu, J., Ravikumar, P., Nguyen, K. T., Hsia, C. C. W., Hong, Y., Gorler, A. Lung protection by inhalation of exogenous solubilized extracellular matrix. PLOS ONE. 12 (2), e0171165 (2017).
- Chen, W. C. W., Wang, Z., et al. Decellularized zebrafish cardiac extracellular matrix induces mammalian heart regeneration. Science Advances. 2 (11), e1600844 (2016).
- Godier-Furnémont, A. F. G., Martens, T. P., et al. Composite scaffold provides a cell delivery platform for cardiovascular repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7974-7979 (2011).
- Sarig, U., Sarig, H., et al. Natural myocardial ECM patch drives cardiac progenitor based restoration even after scarring. Acta Biomaterialia. 44, 209-220 (2016).
- Singelyn, J. M., DeQuach, J. A., Seif-Naraghi, S. B., Littlefield, R. B., Schup-Magoffin, P. J., Christman, K. L. Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering. Biomaterials. 30 (29), 5409-5416 (2009).
