Processamento do tecido cardíaco humano em direção a matriz extracelular auto montagem hidrogel para In Vitro e In Vivo de aplicações
Summary
Este protocolo descreve a decellularization completa do miocárdio humano preservando seus componentes de matriz extracelular. Transformação dos resultados da matriz extracelular na produção de micropartículas e um hidrogel de auto-montagem de tilacoides.
Abstract
Preparações de matriz acelular extracelular são úteis para estudar interações célula-matriz e facilitam aplicações da terapia celular regenerativa. Vários produtos comerciais da matriz extracelular estão disponíveis como hidrogel ou membranas, mas estes não possuem atividade biológica de tecido-específica. Porque decellularization de perfusão geralmente não é possível com o tecido do coração humano, desenvolvemos um processo de decellularization de imersão de 3 passos. Fatias do miocárdio humanas, adquiridas durante a cirurgia são primeiro tratadas com tampão de Lise hiperosmolar livre de detergente, seguida de incubação com o iônico detergente, Dodecil sulfato de sódio, e o processo é concluído, explorando a atividade de DNase intrínseca de soro fetal bovino. Esta técnica resulta em folhas sem célula da matriz extracelular cardíaca com em grande parte preservada composição arquitetura e biopolímero de tecido fibroso, que foram mostrados para fornecer pistas ambientais específicas para populações de células cardíacas e tronco pluripotentes células. Folhas de matriz extracelular cardíaca podem então ser mais transformadas em um pó microparticulado sem mais modificação química, ou, através de digestão de pepsina a curto prazo, em um hidrogel de matriz extracelular cardíaca auto-montagem com conservados Bioatividade.
Introduction
A matriz extracelular (ECM) fornece não somente estrutural apoio mas também é importante para a célula biológica e tecido função1. No coração, o ECM participa na regulação das respostas fisiopatológicas como fibrose, inflamação, angiogênese, função contrátil de casos e viabilidade e destino de células progenitoras residente. Além de seus principais componentes fibrosas glicoproteínas, glicosaminoglicanos e proteoglicanos – contém uma série de fatores de crescimento secretados, citocinas e vesículas membranosas que contém proteínas e ácidos nucleicos2,3.
Recentemente tornou-se claro que preparações de ECM acelulares não são apenas inestimáveis para o estudo de interacções célula-matriz, mas também para potenciais aplicações terapêuticas baseada em célula. A importância de fornecer um ambiente adequado para produtos terapêuticos celular ou tecidos engenharia agora é amplamente reconhecida. Foram feitas tentativas para combinar suspensões celulares ou compostos ativos com hidrogel de biopolymeric definido4,5,6 ou com coquetéis de proteína secretadas pelas células de sarcoma murino (i.e., Matrigel, Geltrex) 7. no entanto, o antigo limitaram bioatividade, estes últimos são problemáticos em processos de qualidade GMP, e ambas faltam a bioatividade de tecido-específica de cardíaca ECM (cECM)8,9,10, 11,12,13.
Decellularization do miocárdio tem sido realizado anteriormente por perfusão do coração toda via a vasculatura coronária14,15. Enquanto isso é possível em animais corações, corações humanos intactas são raramente disponíveis. Portanto, um processo de imersão que permite a manipulação de amostras de tecidos obtidas na sala de cirurgia foi favorecido. Nosso protocolo de “3 passos” contém separado 3 etapas de incubação ou seja Lise, solubilização e remoção de DNA. Que produz o ECM do miocárdio humano com em grande parte preservada da proteína e glicosaminoglicano composição16,17. Essas fatias cECM permitem em vitro estudos de interacções célula-matriz, mas são mal adaptadas para aplicações terapêuticas de potenciais humano-escala. O processo de fabricação estendeu-se então para produzir cECM liofilizado micropartículas ou um hidrogel de cECM18.
Este protocolo permite a decellularization do miocárdio humano obtido de amostras cirúrgicas, preservando os principais componentes da matriz extracelular do miocárdio (ECM) e sua atividade biológica. Este protocolo é recomendado quando ECM cardíaco humano com conserva bioatividade de tecido-específica é necessária para estudos experimentais de interacções célula-matriz, ou quando um ambiente adequado é necessário para abordagens baseadas em células de regeneração miocárdica. Em princípio, também é possível adaptar este protocolo para condições GMP-classe, para que o uso de cECM processado deve ser viáveis aplicações terapêuticas no futuro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ao preparar o ECM do miocárdio humano, o objetivo é alcançar o seguinte: remoção de material celular imunogênica relevante, preservação da integridade de ECM e bioatividade, esterilidade, não-toxicidade do produto final, compatibilidade de GMP-processo, e adequação do produto para um determinado aplicativo em termos de manipulação. Combinando nosso protocolo de decellularization de 3 passos com tratamento subsequente em micropartículas ou auto-montagem hidrogel, material de ECM cardíaco humano é obtido qu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O protocolo do estudo está em conformidade com os princípios éticos descritos na declaração de Helsinque. Pacientes fornecido o consentimento informado para o uso do tecido para fins de investigação, e o processo de coleta de tecido foi aprovado pelo Comitê de ética da Charité – Universitätsmedizin Berlin (EA4/028/12) e Conselho de revisão institucional.
Materials
| Balance | DR Precisa, Dietikon, Switzerland | Precisa XR 205SM | |
| Blades Nr.10 Skalpell Nr.3 | InstrumenteNRW, Erftstadt, Germany | SK-10-004 | |
| Cell culture plates (6-well) | Greiner, Frickenhausen, Germany | 657160 | |
| Cryostat CM | Leica, Wetzlar, Germany | 3050S | |
| EDTA | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8043.3 | |
| Eppendorf reaction tubes (1.5 or 2 ml) | Greiner, Frickenhausen, Germany | 616201, 623201 | |
| Falcon 15ml, 50ml | Greiner, Frickenhausen, Germany | 188271, 227270 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrome, Berlin, Germany | S 0115 | |
| Freeze Dry System | Labconco, Kansas City, USA | 7670520 | |
| Freezer (-80°C) | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | Forma 900 Series | |
| HCl | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 281.1 | |
| Microtome Blades Type 819 | Leica, Wetzlar, Germany | 14035838925 | |
| Minilys Homogeniser | PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Germany | 91-PCSM | |
| NaOH | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | K021.1 | |
| Nystatin | PAN Biotech, Aidenbach, Germany | P06-07800 | |
| PBS | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | 14190-094 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies, Darmstadt, Germany | 15140122 | |
| Pepsin | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | P6887-1G | |
| Precellys Keramik-Kit 1.4 mm | Peqlab Biotechnolgie, Erlangen, Germany | 91-PCS-CK14 | |
| Rotamax 120 Plate shaker | Heidolph, Schwabach, Germany | 544-41200-00 | |
| SDS | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | CN30.3 | |
| Stereo microscope | Leica, Wetzlar, Germany | M125 | |
| Steriflip-GP, 0,22 µm | Merck Millipore, Darmstadt, Germany | SCGP00525 | |
| Stuart analogue rocker & roller mixers | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | Z675113-1EA | |
| Tissue Tek O.C.T compound | Hartenstein, Wurzburg, Germany | TTEK | |
| Transfusion set 200µm | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 798.200.500 | |
| TRIS | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 5429.3 | |
| vedena Skalpellgriff Fig. 3, Standard, 125 mm | Medical Highlights, Rohrdorf, Germany | CV102-003 | |
| Vortex-Genie2 | Scientific Industry, New York, USA | SI-0256 |
References
- Elliott, R., Hoehn, J. Use of Commercial Porcine Skin for Wound Dressings. Plastic and reconstructive surgery. 52 (4), 401-405 (1973).
- Rienks, M., Papageorgiou, A. -. P., Frangogiannis, N. G., Heymans, S. Myocardial Extracellular Matrix: An Ever-Changing and Diverse Entity. Circulation Research. 114 (5), 872-888 (2014).
- Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction. Circulation Research. 119 (1), 91-112 (2016).
- Boopathy, A. V., Martinez, M. D., Smith, A. W., Brown, M. E., Garcia, A. J., Davis, M. Intramyocardial Delivery of Notch Ligand-Containing Hydrogels Improves Cardiac Function and Angiogenesis Following Infarction. Tissue Eng Part A. 21 (17-18), 2315-2322 (2015).
- Gaetani, R., Yin, C., et al. Cardiac derived extracellular matrix enhances cardiogenic properties of human cardiac progenitor cells. Cell Transplant. , (2015).
- Kraehenbuehl, T. P., Ferreira, L. S., et al. Human embryonic stem cell-derived microvascular grafts for cardiac tissue preservation after myocardial infarction. Biomaterials. 32 (4), 1102-1109 (2011).
- Zhang, J., Klos, M., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: The matrix sandwich method. Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).
- Fong, A. H., Romero-López, M., et al. Three-Dimensional Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Maturation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Tissue Engineering Part A. 22 (15-16), 1016-1025 (2016).
- DeQuach, J. A., Mezzano, V., et al. Simple and High Yielding Method for Preparing Tissue Specific Extracellular Matrix Coatings for Cell Culture. PLoS ONE. 5 (9), e13039 (2010).
- Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function. Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).
- Tukmachev, D., Forostyak, S., et al. Injectable extracellular matrix hydrogels as scaffolds for spinal cord injury repair. Tissue Eng Part A. , (2016).
- Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix. Biomaterials. 29 (11), 1630-1637 (2008).
- Singelyn, J. M., Sundaramurthy, P., et al. Catheter-deliverable hydrogel derived from decellularized ventricular extracellular matrix increases endogenous cardiomyocytes and preserves cardiac function post-myocardial infarction. Journal of the American College of Cardiology. 59 (8), 751-763 (2012).
- Wainwright, J. M., Czajka, C. A., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart. Tissue Eng Part C Methods. 16 (3), 525-532 (2010).
- Ott, H. C., Matthiesen, T. S., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).
- Oberwallner, B., Anic, B. A., et al. Human cardiac extracellular matrix supports myocardial lineage commitment of pluripotent stem cells. Eur J Cardiothorac Surg. 47, 416-425 (2015).
- Oberwallner, B., Brodarac, A., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix scaffolds by decellularization of human myocardium. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102 (9), 3263-3272 (2014).
- Kappler, B., Anic, P., et al. The cytoprotective capacity of processed human cardiac extracellular matrix. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. , (2016).
- Bashey, R. I., Martinez-Hernandez, A., Jimenez, S. A. Isolation, characterization, and localization of cardiac collagen type VI. Associations with other extracellular matrix components. Circulation Research. 70 (5), (1992).
- Wu, J., Ravikumar, P., Nguyen, K. T., Hsia, C. C. W., Hong, Y., Gorler, A. Lung protection by inhalation of exogenous solubilized extracellular matrix. PLOS ONE. 12 (2), e0171165 (2017).
- Chen, W. C. W., Wang, Z., et al. Decellularized zebrafish cardiac extracellular matrix induces mammalian heart regeneration. Science Advances. 2 (11), e1600844 (2016).
- Godier-Furnémont, A. F. G., Martens, T. P., et al. Composite scaffold provides a cell delivery platform for cardiovascular repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7974-7979 (2011).
- Sarig, U., Sarig, H., et al. Natural myocardial ECM patch drives cardiac progenitor based restoration even after scarring. Acta Biomaterialia. 44, 209-220 (2016).
- Singelyn, J. M., DeQuach, J. A., Seif-Naraghi, S. B., Littlefield, R. B., Schup-Magoffin, P. J., Christman, K. L. Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering. Biomaterials. 30 (29), 5409-5416 (2009).
