ひと心筋細胞外マトリックスの in VitroとIn Vivo応用のハイドロゲルを自己組織化に向けての処理
Summary
このプロトコルでは、その細胞外マトリックス成分を維持しながらひと心筋の完全な decellularization について説明します。さらに微粒子と胃酸の自己組織化ハイドロゲルの生産における細胞外マトリックスの結果の処理。
Abstract
無細胞性細胞外マトリックス製剤は細胞マトリックスの相互作用を研究するために役立ち、再生細胞療法の適用を容易にします。ゲルまたは膜として商業細胞外マトリックスのいくつかの製品がありますが、これらは組織固有の生物学的活性を持っていません。灌流 decellularization は通常は人間の心臓組織で可能でないために、浸漬 3 段 decellularization プロセスを開発しました。手術中に調達した人間の心筋スライスは最初イオン洗剤、ドデシル硫酸と孵化によって続いて洗剤無料高浸透圧換散バッファーと扱われ、固有の DNase 活性を利用することで完了です。ウシ胎児血清。この手法による心臓の細胞外マトリックスの細胞シートで残されて線維組織のアーキテクチャと生体高分子の組成を示した心臓細胞と多能性幹に特定の環境手がかりを提供するにはセルです。心臓の細胞外マトリックス シート、さらにさらに化学修飾することがなく微粒子粉末に加工したり、短期のペプシン消化経由で自己組織化心臓細胞外マトリックス ハイドロゲルに保存生体活性。
Introduction
細胞外マトリックス (ECM) だけでなく構造サポートが、生物の細胞にとっても重要ですし、組織機能1を提供します。中心部に線維化、炎症、血管新生、心筋収縮機能、生存率、および居住者の前駆細胞の運命などの病態生理学的応答の調節における ECM が参加しています。その主要なコンポーネント – 線維性糖タンパク質、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン – に加えて分泌された成長因子、サイトカイン、および核酸, 蛋白質の2,の3を含む膜小胞のホストが含まれます。
最近、無細胞性 ECM 準備がだけ潜在的な治療上のセル ベースのアプリケーションにとっても、細胞マトリックスの相互作用を研究するため非常に貴重ではないこと明確ななっています。治療細胞製品、エンジニア リング組織に適切な環境を提供することの重要性が広く認められています。定義された biopolymeric ゲル4,5,6またはマウス肉腫細胞 (すなわちマトリゲル、Geltrex) から分泌されるタンパク質カクテル細胞懸濁液または活性化合物を結合する試みがなされました。7しますただし、元の生物活性を限られている、後者は GMP グレード プロセスで問題が発生、心臓 ECM (cECM)8,9,10,の組織固有活性の両方に欠ける。11,12,13。
心筋の decellularization は以前冠血管14,15を介して心臓全体の灌流によって行われています。これは動物の心で可能ですが、そのまま人間の心はほとんどあります。したがって、手術で得られた組織のサンプルを処理することができます浸漬プロセスが支持されました。私たちの「3 ステップ」プロトコルは、別の 3 を含んでいるインキュベーション手順すなわち溶解、可溶化、および DNA 除去。それは主に保存されタンパク質とグリコサミノグリカンの構成16,17ヒト心筋 ECM を得られます。これらの cECM スライス体外細胞マトリックスの相互作用の研究を可能にするが、悪い潜在的な人間のスケールの治療への応用に適しています。製造工程、凍結乾燥 cECM 微粒子または cECM ハイドロゲル18生成に延長されました。
このプロトコルは、心筋細胞外マトリックス (ECM) とその生物学的活性の主要なコンポーネントを維持、手術標本から得られるひと心筋の decellularization を使用できます。保存された組織固有の生物活性を持つヒトの心臓 ECM が細胞マトリックスの相互作用に関する実験的研究に必要な場合、または細胞を用いた心筋再生のアプローチに適した環境が必要な場合は、このプロトコルをお勧めします。原則として、処理された cECM の使用は、実現可能な将来の治療への応用をする必要がありますにも GMP グレードの条件このプロトコルに適応する可能です。
Protocol
Representative Results
Discussion
目標は次を達成するために、ヒトの心筋 ECM を準備するとき: 免疫細胞の関連資料、ECM の整合性と生理、不妊、最終製品、GMP プロセス互換性の非毒性の保全の除去と処理の面で特定のアプリケーションのための製品の適合性。微粒子や自己組織化ハイドロゲルにさらなる処理と私たち 3 段 decellularization プロトコルを組み合わせて、人間の心臓の ECM 材料が得られ、特定の生物学的作用を有し?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
研究プロトコルは、ヘルシンキ宣言に記載されている倫理原則に準拠しています。患者組織の研究目的のための使用のためのインフォームド コンセントの提供し、組織を収集するプロセスは、制度検討委員会とシャリテ ・ ベルリン Universitätsmedizin (EA4/028/12) の倫理委員会によって承認されました。
Materials
| Balance | DR Precisa, Dietikon, Switzerland | Precisa XR 205SM | |
| Blades Nr.10 Skalpell Nr.3 | InstrumenteNRW, Erftstadt, Germany | SK-10-004 | |
| Cell culture plates (6-well) | Greiner, Frickenhausen, Germany | 657160 | |
| Cryostat CM | Leica, Wetzlar, Germany | 3050S | |
| EDTA | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8043.3 | |
| Eppendorf reaction tubes (1.5 or 2 ml) | Greiner, Frickenhausen, Germany | 616201, 623201 | |
| Falcon 15ml, 50ml | Greiner, Frickenhausen, Germany | 188271, 227270 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrome, Berlin, Germany | S 0115 | |
| Freeze Dry System | Labconco, Kansas City, USA | 7670520 | |
| Freezer (-80°C) | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | Forma 900 Series | |
| HCl | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 281.1 | |
| Microtome Blades Type 819 | Leica, Wetzlar, Germany | 14035838925 | |
| Minilys Homogeniser | PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Germany | 91-PCSM | |
| NaOH | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | K021.1 | |
| Nystatin | PAN Biotech, Aidenbach, Germany | P06-07800 | |
| PBS | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | 14190-094 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies, Darmstadt, Germany | 15140122 | |
| Pepsin | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | P6887-1G | |
| Precellys Keramik-Kit 1.4 mm | Peqlab Biotechnolgie, Erlangen, Germany | 91-PCS-CK14 | |
| Rotamax 120 Plate shaker | Heidolph, Schwabach, Germany | 544-41200-00 | |
| SDS | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | CN30.3 | |
| Stereo microscope | Leica, Wetzlar, Germany | M125 | |
| Steriflip-GP, 0,22 µm | Merck Millipore, Darmstadt, Germany | SCGP00525 | |
| Stuart analogue rocker & roller mixers | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | Z675113-1EA | |
| Tissue Tek O.C.T compound | Hartenstein, Wurzburg, Germany | TTEK | |
| Transfusion set 200µm | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 798.200.500 | |
| TRIS | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 5429.3 | |
| vedena Skalpellgriff Fig. 3, Standard, 125 mm | Medical Highlights, Rohrdorf, Germany | CV102-003 | |
| Vortex-Genie2 | Scientific Industry, New York, USA | SI-0256 |
References
- Elliott, R., Hoehn, J. Use of Commercial Porcine Skin for Wound Dressings. Plastic and reconstructive surgery. 52 (4), 401-405 (1973).
- Rienks, M., Papageorgiou, A. -. P., Frangogiannis, N. G., Heymans, S. Myocardial Extracellular Matrix: An Ever-Changing and Diverse Entity. Circulation Research. 114 (5), 872-888 (2014).
- Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction. Circulation Research. 119 (1), 91-112 (2016).
- Boopathy, A. V., Martinez, M. D., Smith, A. W., Brown, M. E., Garcia, A. J., Davis, M. Intramyocardial Delivery of Notch Ligand-Containing Hydrogels Improves Cardiac Function and Angiogenesis Following Infarction. Tissue Eng Part A. 21 (17-18), 2315-2322 (2015).
- Gaetani, R., Yin, C., et al. Cardiac derived extracellular matrix enhances cardiogenic properties of human cardiac progenitor cells. Cell Transplant. , (2015).
- Kraehenbuehl, T. P., Ferreira, L. S., et al. Human embryonic stem cell-derived microvascular grafts for cardiac tissue preservation after myocardial infarction. Biomaterials. 32 (4), 1102-1109 (2011).
- Zhang, J., Klos, M., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: The matrix sandwich method. Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).
- Fong, A. H., Romero-López, M., et al. Three-Dimensional Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Maturation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Tissue Engineering Part A. 22 (15-16), 1016-1025 (2016).
- DeQuach, J. A., Mezzano, V., et al. Simple and High Yielding Method for Preparing Tissue Specific Extracellular Matrix Coatings for Cell Culture. PLoS ONE. 5 (9), e13039 (2010).
- Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function. Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).
- Tukmachev, D., Forostyak, S., et al. Injectable extracellular matrix hydrogels as scaffolds for spinal cord injury repair. Tissue Eng Part A. , (2016).
- Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix. Biomaterials. 29 (11), 1630-1637 (2008).
- Singelyn, J. M., Sundaramurthy, P., et al. Catheter-deliverable hydrogel derived from decellularized ventricular extracellular matrix increases endogenous cardiomyocytes and preserves cardiac function post-myocardial infarction. Journal of the American College of Cardiology. 59 (8), 751-763 (2012).
- Wainwright, J. M., Czajka, C. A., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart. Tissue Eng Part C Methods. 16 (3), 525-532 (2010).
- Ott, H. C., Matthiesen, T. S., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).
- Oberwallner, B., Anic, B. A., et al. Human cardiac extracellular matrix supports myocardial lineage commitment of pluripotent stem cells. Eur J Cardiothorac Surg. 47, 416-425 (2015).
- Oberwallner, B., Brodarac, A., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix scaffolds by decellularization of human myocardium. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102 (9), 3263-3272 (2014).
- Kappler, B., Anic, P., et al. The cytoprotective capacity of processed human cardiac extracellular matrix. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. , (2016).
- Bashey, R. I., Martinez-Hernandez, A., Jimenez, S. A. Isolation, characterization, and localization of cardiac collagen type VI. Associations with other extracellular matrix components. Circulation Research. 70 (5), (1992).
- Wu, J., Ravikumar, P., Nguyen, K. T., Hsia, C. C. W., Hong, Y., Gorler, A. Lung protection by inhalation of exogenous solubilized extracellular matrix. PLOS ONE. 12 (2), e0171165 (2017).
- Chen, W. C. W., Wang, Z., et al. Decellularized zebrafish cardiac extracellular matrix induces mammalian heart regeneration. Science Advances. 2 (11), e1600844 (2016).
- Godier-Furnémont, A. F. G., Martens, T. P., et al. Composite scaffold provides a cell delivery platform for cardiovascular repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7974-7979 (2011).
- Sarig, U., Sarig, H., et al. Natural myocardial ECM patch drives cardiac progenitor based restoration even after scarring. Acta Biomaterialia. 44, 209-220 (2016).
- Singelyn, J. M., DeQuach, J. A., Seif-Naraghi, S. B., Littlefield, R. B., Schup-Magoffin, P. J., Christman, K. L. Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering. Biomaterials. 30 (29), 5409-5416 (2009).
