עיבוד של רקמת הלב האנושי כלפי עצמי בהרכבת הידרוג במבחנה ויישומים In Vivo מטריצה חוץ-תאית
Summary
פרוטוקול זה מתאר את decellularization מלא של שריר הלב האנושי תוך שמירה על מרכיביו מטריצה חוץ-תאית. עיבוד נוסף של התוצאות מטריצה חוץ-תאית בייצור של microparticles ו הידרוג וההספק עצמית של cytoprotective.
Abstract
מטריצה חוץ-תאית acellular ההכנות שימושיים עבור לימוד אינטראקציות סלולרי-מטריקס ולהקל תא משובי טיפול יישומים. מספר מוצרים מסחריים מטריצה חוץ-תאית זמינים כמו hydrogels או ממברנות, אך אלה לא ניחנת פעילות ביולוגית רקמות ספציפיות. כי זלוף decellularization בדרך כלל לא אפשרי עם רקמת הלב האנושי, פיתחנו תהליך decellularization 3-צעד טבילה. פרוסות שריר הלב האנושי רכש במהלך הניתוח הראשון שטופלו hyperosmolar דטרגנט ללא פירוק מאגר, ואחריו הדגירה עם יונית דטרגנט, dodecyl סולפט נתרן, ואת התהליך הושלם על ידי ניצול הפעילות DNase מהותי של סרום שור בעובר. טכניקה זו התוצאה ללא תא גיליונות של מטריצה חוץ-תאית לב עם נשמר בעיקר סיבי רקמת ביופולימרים ואדריכלות הרכב, אשר הוצגו לספק רמזים סביבתיים מסוימים כדי אוכלוסיות הלב תא גזע pluripotent תאים. מטריצה חוץ-תאית לב גליונות שניתן ואז עוד יותר מעובד לאבקה microparticle ללא שינוי כימי נוסף או, באמצעות עיכול פפסין לטווח קצר, לתוך הידרוג מטריצה חוץ-תאית לב וההספק עצמית עם משומר אתריים.
Introduction
מטריצות (ECM) מספק לא רק מבנה תומך אבל חשוב גם עבור תא ביולוגי, רקמות לתפקד1. בלב, ECM משתתף בוויסות תגובות pathophysiologic כגון פיברוזיס, דלקת, אנגיוגנזה, הפונקציה כויץ cardiomyocyte ואת הכדאיות קדמון תושב גורל. בנוסף מרכיביו העיקריים – סיבי glycoproteins, glycosaminoglycans ו proteoglycans – הוא מכיל שורה של גורמי גדילה מופרשים ציטוקינים, עלי הלוואי קרומיים שלפוחית המכילה2,של חומצות גרעין וחלבונים –3.
זה הפך לאחרונה כי ההכנות ECM acellular הן לא רק שלא יסולא בפז ללמוד אינטראקציות סלולרי-מטריקס, אלא גם עבור יישומים פוטנציאליים מבוססת תא טיפולית. החשיבות של מתן סביבה נאותה התא טיפולית מוצרים או רקמות מהונדסים כעת ידוע נרחב. נעשים ניסיונות לשלב תא המתלים או חומרים פעילים עם מוגדר hydrogels biopolymeric4,5,6 או עם קוקטיילים חלבון מופרש על ידי תאי מאתר סרקומה (קרי, Matrigel, Geltrex) 7. עם זאת, לשעבר מוגבלת אתריים האחרונים הם בעייתיים בתהליכים GMP-כיתה, שניהם חסרים את אתריים רקמות ספציפיות של הלב ECM (cECM)8,9,10, 11,12,13.
Decellularization של שריר הלב בעבר בוצעה על ידי זלוף בלב שלם באמצעות ה-14,להערכת כלילית15. אמנם זה אפשרי בלבבות בעלי חיים, לבבות אדם שלם זמינים רק לעתים רחוקות. לפיכך, תהליך טבילה המאפשר טיפול דגימות רקמה שהושג בחדר הניתוח היה המועדף. פרוטוקול “3-צעד” שלנו מכיל 3 נפרד הדגירה שלבים כלומר פירוק, solubilization, והסרת ה-DNA. זה מניב ECM שריר הלב האנושי עם משומר בעיקר חלבון, גליקוזאמינוגליקן קומפוזיציה16,17. פרוסות cECM אלה מאפשרים מחקרים במבחנה של התא-מטריקס אינטראקציות אבל מתאים היטב עבור יישומים פוטנציאליים בקנה מידה האדם טיפולית. תהליך הייצור הוארך אז כדי לייצר lyophilized cECM microparticles או של הידרוג cECM18.
פרוטוקול זה מאפשר decellularization של שריר הלב האנושי המתקבל דגימות כירורגי, שמירה על המרכיבים העיקריים של מטריצה חוץ-תאית שריר הלב (ECM) ופעילותם וחיסונים. פרוטוקול זה מומלץ כאשר ECM הלב האנושי עם אתריים רקמות ספציפיות שהשתמרו נדרשת ללימודים ניסיוני של אינטראקציות סלולרי-מטריקס, או כאשר סביבה מתאימה יש צורך גישות מבוססות תא התחדשות שריר הלב. בעקרון, זה גם אפשרי להתאים פרוטוקול זה בתנאי GMP-כיתה, כך השימוש cECM מעובד צריך להיות ריאלי יישומים טיפוליים בעתיד.
Protocol
Representative Results
Discussion
בעת הכנת ECM שריר הלב האנושי, המטרה היא להשיג את הדברים הבאים: הסרת חומרים רלוונטיים הסלולר immunogenic, שמירה על שלמות ECM ו אתריים, עקרות, אי רעילות של המוצר הסופי, תאימות GMP-תהליך, ו התאמת המוצר עבור יישום נתון במונחים של טיפול. על ידי שילוב פרוטוקול 3-צעד decellularization שלנו עם עיבוד נוסף לתוך microparticles או…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
פרוטוקול המחקר תואמת עקרונות אתיים שמתואר את הצהרת הלסינקי. חולים שסופקו מדעת לשימוש של הרקמה למטרות מחקר, התהליך של איסוף רקמת אושרה על ידי הועד המוסדי יו ר ועדת האתיקה של צ’אריטה – Universitätsmedizin ברלין (EA4/028/12).
Materials
| Balance | DR Precisa, Dietikon, Switzerland | Precisa XR 205SM | |
| Blades Nr.10 Skalpell Nr.3 | InstrumenteNRW, Erftstadt, Germany | SK-10-004 | |
| Cell culture plates (6-well) | Greiner, Frickenhausen, Germany | 657160 | |
| Cryostat CM | Leica, Wetzlar, Germany | 3050S | |
| EDTA | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8043.3 | |
| Eppendorf reaction tubes (1.5 or 2 ml) | Greiner, Frickenhausen, Germany | 616201, 623201 | |
| Falcon 15ml, 50ml | Greiner, Frickenhausen, Germany | 188271, 227270 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrome, Berlin, Germany | S 0115 | |
| Freeze Dry System | Labconco, Kansas City, USA | 7670520 | |
| Freezer (-80°C) | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | Forma 900 Series | |
| HCl | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 281.1 | |
| Microtome Blades Type 819 | Leica, Wetzlar, Germany | 14035838925 | |
| Minilys Homogeniser | PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Germany | 91-PCSM | |
| NaOH | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | K021.1 | |
| Nystatin | PAN Biotech, Aidenbach, Germany | P06-07800 | |
| PBS | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | 14190-094 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies, Darmstadt, Germany | 15140122 | |
| Pepsin | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | P6887-1G | |
| Precellys Keramik-Kit 1.4 mm | Peqlab Biotechnolgie, Erlangen, Germany | 91-PCS-CK14 | |
| Rotamax 120 Plate shaker | Heidolph, Schwabach, Germany | 544-41200-00 | |
| SDS | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | CN30.3 | |
| Stereo microscope | Leica, Wetzlar, Germany | M125 | |
| Steriflip-GP, 0,22 µm | Merck Millipore, Darmstadt, Germany | SCGP00525 | |
| Stuart analogue rocker & roller mixers | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | Z675113-1EA | |
| Tissue Tek O.C.T compound | Hartenstein, Wurzburg, Germany | TTEK | |
| Transfusion set 200µm | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 798.200.500 | |
| TRIS | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 5429.3 | |
| vedena Skalpellgriff Fig. 3, Standard, 125 mm | Medical Highlights, Rohrdorf, Germany | CV102-003 | |
| Vortex-Genie2 | Scientific Industry, New York, USA | SI-0256 |
References
- Elliott, R., Hoehn, J. Use of Commercial Porcine Skin for Wound Dressings. Plastic and reconstructive surgery. 52 (4), 401-405 (1973).
- Rienks, M., Papageorgiou, A. -. P., Frangogiannis, N. G., Heymans, S. Myocardial Extracellular Matrix: An Ever-Changing and Diverse Entity. Circulation Research. 114 (5), 872-888 (2014).
- Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction. Circulation Research. 119 (1), 91-112 (2016).
- Boopathy, A. V., Martinez, M. D., Smith, A. W., Brown, M. E., Garcia, A. J., Davis, M. Intramyocardial Delivery of Notch Ligand-Containing Hydrogels Improves Cardiac Function and Angiogenesis Following Infarction. Tissue Eng Part A. 21 (17-18), 2315-2322 (2015).
- Gaetani, R., Yin, C., et al. Cardiac derived extracellular matrix enhances cardiogenic properties of human cardiac progenitor cells. Cell Transplant. , (2015).
- Kraehenbuehl, T. P., Ferreira, L. S., et al. Human embryonic stem cell-derived microvascular grafts for cardiac tissue preservation after myocardial infarction. Biomaterials. 32 (4), 1102-1109 (2011).
- Zhang, J., Klos, M., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: The matrix sandwich method. Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).
- Fong, A. H., Romero-López, M., et al. Three-Dimensional Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Maturation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Tissue Engineering Part A. 22 (15-16), 1016-1025 (2016).
- DeQuach, J. A., Mezzano, V., et al. Simple and High Yielding Method for Preparing Tissue Specific Extracellular Matrix Coatings for Cell Culture. PLoS ONE. 5 (9), e13039 (2010).
- Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function. Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).
- Tukmachev, D., Forostyak, S., et al. Injectable extracellular matrix hydrogels as scaffolds for spinal cord injury repair. Tissue Eng Part A. , (2016).
- Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix. Biomaterials. 29 (11), 1630-1637 (2008).
- Singelyn, J. M., Sundaramurthy, P., et al. Catheter-deliverable hydrogel derived from decellularized ventricular extracellular matrix increases endogenous cardiomyocytes and preserves cardiac function post-myocardial infarction. Journal of the American College of Cardiology. 59 (8), 751-763 (2012).
- Wainwright, J. M., Czajka, C. A., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart. Tissue Eng Part C Methods. 16 (3), 525-532 (2010).
- Ott, H. C., Matthiesen, T. S., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).
- Oberwallner, B., Anic, B. A., et al. Human cardiac extracellular matrix supports myocardial lineage commitment of pluripotent stem cells. Eur J Cardiothorac Surg. 47, 416-425 (2015).
- Oberwallner, B., Brodarac, A., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix scaffolds by decellularization of human myocardium. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102 (9), 3263-3272 (2014).
- Kappler, B., Anic, P., et al. The cytoprotective capacity of processed human cardiac extracellular matrix. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. , (2016).
- Bashey, R. I., Martinez-Hernandez, A., Jimenez, S. A. Isolation, characterization, and localization of cardiac collagen type VI. Associations with other extracellular matrix components. Circulation Research. 70 (5), (1992).
- Wu, J., Ravikumar, P., Nguyen, K. T., Hsia, C. C. W., Hong, Y., Gorler, A. Lung protection by inhalation of exogenous solubilized extracellular matrix. PLOS ONE. 12 (2), e0171165 (2017).
- Chen, W. C. W., Wang, Z., et al. Decellularized zebrafish cardiac extracellular matrix induces mammalian heart regeneration. Science Advances. 2 (11), e1600844 (2016).
- Godier-Furnémont, A. F. G., Martens, T. P., et al. Composite scaffold provides a cell delivery platform for cardiovascular repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7974-7979 (2011).
- Sarig, U., Sarig, H., et al. Natural myocardial ECM patch drives cardiac progenitor based restoration even after scarring. Acta Biomaterialia. 44, 209-220 (2016).
- Singelyn, J. M., DeQuach, J. A., Seif-Naraghi, S. B., Littlefield, R. B., Schup-Magoffin, P. J., Christman, K. L. Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering. Biomaterials. 30 (29), 5409-5416 (2009).
