التجهيز لانسجة القلب البشري تجاه المصفوفة خارج الخلية التي ذاتية تجميع المائية في المختبر و في فيفو التطبيقات
Summary
ويصف هذا البروتوكول ديسيلولاريزيشن الكامل لعضلة القلب البشري مع الحفاظ على عناصر المصفوفة خارج الخلية. الاستمرار في معالجة نتائج المصفوفة خارج الخلية في إنتاج المجهرية الدقيقة والمائية تجميع ذاتي سيتوبروتيكتيفي.
Abstract
الاستعدادات اللاخلوي المصفوفة خارج الخلية هي مفيدة لدراسة التفاعلات الخلية-مصفوفة وتسهيل تطبيقات العلاج خلية التجدد. تتوفر العديد من المنتجات التجارية المصفوفة خارج الخلية الهلاميات المائية أو الأغشية، ولكن هذه لا تملك أنسجة محددة النشاط البيولوجي. لأنه عادة ما ديسيلولاريزيشن التروية غير ممكن مع أنسجة قلب الإنسان، قمنا بتطوير عملية ديسيلولاريزيشن غمر الخطوة 3. شرائح احتشاء عضلة القلب البشري المشتراة خلال الجراحة أولاً تعامل مع المخزن المؤقت لتحلل الاسموليه خالية من المنظفات، تليها الحضانة مع دوديسيل كبريتات الصوديوم الأيونية المنظفات، وإتمام العملية عن طريق استغلال نشاط الدناز الجوهرية مصل الدم البقري الجنين. نتائج هذا الأسلوب في أوراق القلب المصفوفة خارج الخلية مع خلية خالية إلى حد كبير الحفاظ على تكوين النسيج الليفي العمارة وبيوبوليمير، التي عرضت تقديم منبهات بيئية محددة للسكان خلية القلب والجذعيه pluripotent الخلايا. أوراق القلب المصفوفة خارج الخلية يمكن ثم كذلك المجهزة إلى مسحوق يمثل دون تعديل المواد الكيميائية كذلك، أو، عن طريق الهضم بيبسن قصيرة الأجل، وإلى المائية مصفوفة خارج الخلية قلبية تجميع ذاتي مع الحفاظ على بيواكتيفيتي.
Introduction
المصفوفة خارج الخلية (ECM) يوفر ليس فقط دعم الهيكلية ولكن مهم أيضا للخلية البيولوجية والأنسجة تعمل1. في القلب، ويشارك إدارة المحتوى في المؤسسة في تنظيم استجابات باثوفيسيولوجيك مثل التليف والتهاب والأوعية، والدالة الهوس كارديوميوسيتي وبقاء ومصير الخلية السلف المقيمين. بالإضافة إلى مكوناته الأولية-glycoproteins الليفي والجليكوزامينوجليكان وبروتيوجليكانس–أنه يحتوي على مجموعة من عوامل النمو يفرز، السيتوكينات، والحويصلات الغشائية التي تحتوي على الأحماض النووية والبروتينات2،3.
مؤخرا أصبح من الواضح أن اللاخلوي ECM الاستعدادات ليست فقط لا تقدر بثمن لدراسة التفاعلات الخلية-مصفوفة، بل أيضا للتطبيقات المستندة إلى الخلية العلاجية المحتملة. أهمية توفير بيئة ملائمة للمنتجات العلاجية الخلايا أو الأنسجة المهندسة هو الآن على نطاق واسع. وقد بذلت محاولات للجمع بين تعليق خلية أو المركبات النشطة مع المعرفة الهلاميات المائية بيوبوليميريك4،،من56 أو مع الكوكتيل بروتين يفرز من الخلايا ساركومه مورين (أي، ماتريجيل، جيلتريكس) 7-بيد السابقة محدودة بيواكتيفيتي، هذه الأخيرة إشكالية في عمليات برنامج الرصد العالمي-الصف، وكلاهما يفتقر بيواكتيفيتي الخاصة بأنسجة القلب ECM (الوزاري)8،،من910، 11،،من1213.
ديسيلولاريزيشن عضلة القلب كانت تؤديها سابقا نضح قلب كله عن طريق ال14،المفرج التاجية15. حين يكون ذلك ممكناً في قلوب الحيوان، قلوب البشر سليمة تتوفر إلا نادراً. ولذلك، كان يفضل عملية غمر الذي يسمح لمعالجة عينات الأنسجة التي تم الحصول عليها في غرفة العمليات. ويتضمن البروتوكول “3-خطوة” لدينا منفصلة 3 حضانة الخطوات هي تحلل، سولوبيليزيشن، وإزالة الحمض النووي. غلة ECM احتشاء عضلة القلب البشري إلى حد كبير الحفاظ على البروتين و glycosaminoglycan تكوين16،17. هذه الشرائح الوزاري السماح للدراسات في المختبر من تفاعلات الخلية-مصفوفة ولكن سيئة مناسبة للتطبيقات العلاجية المحتملة على الإنسان على نطاق. ثم تم تمديد عملية التصنيع لإنتاج المجهرية الدقيقة الوزاري المجففة بالتبريد أو المائية الوزاري18.
يسمح هذا البروتوكول ديسيلولاريزيشن لعضلة القلب البشري التي تم الحصول عليها من عينات جراحية، الحفاظ على المكونات الرئيسية للمصفوفة خارج الخلية احتشاء عضلة القلب (ECM) ونشاطهم البيولوجية. يوصي بهذا البروتوكول عندما ECM القلب البشري مع الحفاظ على الأنسجة على حدة بيواكتيفيتي مطلوب للدراسات التجريبية من تفاعلات الخلية-مصفوفة، أو عند الحاجة إلى بيئة ملائمة لنهج يستند إلى الخلية التجديد احتشاء عضلة القلب. من حيث المبدأ، من الممكن أيضا التكيف مع هذا البروتوكول إلى شروط GMP الصف، حيث أنه ينبغي استخدام الوزاري المجهزة التطبيقات العلاجية في المستقبل ممكناً.
Protocol
Representative Results
Discussion
عند إعداد المحتوى احتشاء عضلة القلب البشري، ويهدف إلى تحقيق ما يلي: إزالة المواد الخلوية مكسبه ذات الصلة، والحفاظ على سلامة إدارة المحتوى في المؤسسة وبيواكتيفيتي، العقم، غير سمية للناتج النهائي، برنامج الرصد العالمي-عملية التوافق، و مدى ملاءمة المنتج لتطبيق محدد من حيث التعامل. عن طريق ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
بروتوكول الدراسة تتفق مع المبادئ الأخلاقية المبينة في “إعلان هلسنكي”. المرضى المقدمة المستنيرة لاستخدام الأنسجة لأغراض البحث، وأقر عملية جمع النسيج “المؤسسي استعراض المجلس” ولجنة الأخلاقيات في مستشفى الشارتي-برلين Universitätsmedizin (EA4/028/12).
Materials
| Balance | DR Precisa, Dietikon, Switzerland | Precisa XR 205SM | |
| Blades Nr.10 Skalpell Nr.3 | InstrumenteNRW, Erftstadt, Germany | SK-10-004 | |
| Cell culture plates (6-well) | Greiner, Frickenhausen, Germany | 657160 | |
| Cryostat CM | Leica, Wetzlar, Germany | 3050S | |
| EDTA | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8043.3 | |
| Eppendorf reaction tubes (1.5 or 2 ml) | Greiner, Frickenhausen, Germany | 616201, 623201 | |
| Falcon 15ml, 50ml | Greiner, Frickenhausen, Germany | 188271, 227270 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrome, Berlin, Germany | S 0115 | |
| Freeze Dry System | Labconco, Kansas City, USA | 7670520 | |
| Freezer (-80°C) | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | Forma 900 Series | |
| HCl | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 281.1 | |
| Microtome Blades Type 819 | Leica, Wetzlar, Germany | 14035838925 | |
| Minilys Homogeniser | PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Germany | 91-PCSM | |
| NaOH | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | K021.1 | |
| Nystatin | PAN Biotech, Aidenbach, Germany | P06-07800 | |
| PBS | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | 14190-094 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies, Darmstadt, Germany | 15140122 | |
| Pepsin | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | P6887-1G | |
| Precellys Keramik-Kit 1.4 mm | Peqlab Biotechnolgie, Erlangen, Germany | 91-PCS-CK14 | |
| Rotamax 120 Plate shaker | Heidolph, Schwabach, Germany | 544-41200-00 | |
| SDS | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | CN30.3 | |
| Stereo microscope | Leica, Wetzlar, Germany | M125 | |
| Steriflip-GP, 0,22 µm | Merck Millipore, Darmstadt, Germany | SCGP00525 | |
| Stuart analogue rocker & roller mixers | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | Z675113-1EA | |
| Tissue Tek O.C.T compound | Hartenstein, Wurzburg, Germany | TTEK | |
| Transfusion set 200µm | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 798.200.500 | |
| TRIS | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 5429.3 | |
| vedena Skalpellgriff Fig. 3, Standard, 125 mm | Medical Highlights, Rohrdorf, Germany | CV102-003 | |
| Vortex-Genie2 | Scientific Industry, New York, USA | SI-0256 |
References
- Elliott, R., Hoehn, J. Use of Commercial Porcine Skin for Wound Dressings. Plastic and reconstructive surgery. 52 (4), 401-405 (1973).
- Rienks, M., Papageorgiou, A. -. P., Frangogiannis, N. G., Heymans, S. Myocardial Extracellular Matrix: An Ever-Changing and Diverse Entity. Circulation Research. 114 (5), 872-888 (2014).
- Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction. Circulation Research. 119 (1), 91-112 (2016).
- Boopathy, A. V., Martinez, M. D., Smith, A. W., Brown, M. E., Garcia, A. J., Davis, M. Intramyocardial Delivery of Notch Ligand-Containing Hydrogels Improves Cardiac Function and Angiogenesis Following Infarction. Tissue Eng Part A. 21 (17-18), 2315-2322 (2015).
- Gaetani, R., Yin, C., et al. Cardiac derived extracellular matrix enhances cardiogenic properties of human cardiac progenitor cells. Cell Transplant. , (2015).
- Kraehenbuehl, T. P., Ferreira, L. S., et al. Human embryonic stem cell-derived microvascular grafts for cardiac tissue preservation after myocardial infarction. Biomaterials. 32 (4), 1102-1109 (2011).
- Zhang, J., Klos, M., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: The matrix sandwich method. Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).
- Fong, A. H., Romero-López, M., et al. Three-Dimensional Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Maturation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Tissue Engineering Part A. 22 (15-16), 1016-1025 (2016).
- DeQuach, J. A., Mezzano, V., et al. Simple and High Yielding Method for Preparing Tissue Specific Extracellular Matrix Coatings for Cell Culture. PLoS ONE. 5 (9), e13039 (2010).
- Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function. Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).
- Tukmachev, D., Forostyak, S., et al. Injectable extracellular matrix hydrogels as scaffolds for spinal cord injury repair. Tissue Eng Part A. , (2016).
- Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix. Biomaterials. 29 (11), 1630-1637 (2008).
- Singelyn, J. M., Sundaramurthy, P., et al. Catheter-deliverable hydrogel derived from decellularized ventricular extracellular matrix increases endogenous cardiomyocytes and preserves cardiac function post-myocardial infarction. Journal of the American College of Cardiology. 59 (8), 751-763 (2012).
- Wainwright, J. M., Czajka, C. A., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart. Tissue Eng Part C Methods. 16 (3), 525-532 (2010).
- Ott, H. C., Matthiesen, T. S., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).
- Oberwallner, B., Anic, B. A., et al. Human cardiac extracellular matrix supports myocardial lineage commitment of pluripotent stem cells. Eur J Cardiothorac Surg. 47, 416-425 (2015).
- Oberwallner, B., Brodarac, A., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix scaffolds by decellularization of human myocardium. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102 (9), 3263-3272 (2014).
- Kappler, B., Anic, P., et al. The cytoprotective capacity of processed human cardiac extracellular matrix. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. , (2016).
- Bashey, R. I., Martinez-Hernandez, A., Jimenez, S. A. Isolation, characterization, and localization of cardiac collagen type VI. Associations with other extracellular matrix components. Circulation Research. 70 (5), (1992).
- Wu, J., Ravikumar, P., Nguyen, K. T., Hsia, C. C. W., Hong, Y., Gorler, A. Lung protection by inhalation of exogenous solubilized extracellular matrix. PLOS ONE. 12 (2), e0171165 (2017).
- Chen, W. C. W., Wang, Z., et al. Decellularized zebrafish cardiac extracellular matrix induces mammalian heart regeneration. Science Advances. 2 (11), e1600844 (2016).
- Godier-Furnémont, A. F. G., Martens, T. P., et al. Composite scaffold provides a cell delivery platform for cardiovascular repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7974-7979 (2011).
- Sarig, U., Sarig, H., et al. Natural myocardial ECM patch drives cardiac progenitor based restoration even after scarring. Acta Biomaterialia. 44, 209-220 (2016).
- Singelyn, J. M., DeQuach, J. A., Seif-Naraghi, S. B., Littlefield, R. B., Schup-Magoffin, P. J., Christman, K. L. Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering. Biomaterials. 30 (29), 5409-5416 (2009).
