血液-脳関門の高分解能共焦点イメージング: イメージング、三次元、トランスサイトーシスの定量化

この研究のための倫理的な承認は、連邦食品の安全性とスイス連邦共和国の獣医のオフィスによって提供されました。動物の保護と福祉だけでなく評価・認定の研究所動物ケア国際 (AAALAC) 会の規則に従ってスイス連邦政府令を厳守ですべての動物実験を行なった。 1 です脳の Free-floating セクションの生成 最適なサンプルの質を確保するため 2% パラホルムアルデヒド (PFA) の新鮮なソリューションのリン酸バッファー生理食塩水 (PBS) で灌流の日準備。 。 注意: PFA は適度に皮膚に接触し、ありそうな発癌物質有毒物質です。PFA を処理し、化学の発煙のフードの下で溶液を調製するニトリル手袋を使用します。 動物あたり PFA 溶液 60 mL を準備します。 180-200 μ L の PBS のすべて 100 ml 5 M KOH 溶液で pH を大きくして 60 までソリューションを加熱によってソリューションにもたらす PFA ° C 注: 水酸化ナトリウム使用しないでください組織保存固定に否定的影響を及ぼす。 室温までソリューションを冷ます、ろ紙を使用してソリューション塩酸フィルターを用いた 7.4 まで pH をもたらす (材料の表 を参照してください). いくつかの変更と前述の 15 transcardial 血流を介して全体のマウス固定を行います。まず、20 mL の PBS を使用して血管から血液をフラッシュし、40 ml の 2% の灌流 PFA。 上記 15 として頭蓋骨から脳を削除します。 浸、たて 2 %pfa 灌流脳 2 mL にポスト固定のための 4 ° C で 7 h の PFA 。 注: PFA でインキュベーションを増やすことはお勧めできません、細胞内構造の検出を防ぐことができます。 氷冷 PBS で脳を広範囲洗浄します。 Agarose の脳を固定埋め込む。 電子レンジを使用して加熱の PBS で 準備 3% の agarose ソリューションです。冷却凝固を避けるためにソリューションをゆっくり旋回します。 はプラスチック容器にアガロース溶液に浸漬する前に脳の周りの PBS の過剰に乾かします。空気の泡を削除する agarose の中の脳を回転させます。氷で冷却して固めるためアガロースを許可 は慎重にプラスチック容器からアガロース ブロックを削除し、かみそりの刃を使用して脳の周りのキューブをカットします。Vibratome 試料ホルダーに脳をマウント (材料表 参照) シアノアクリ レート系接着剤を使用 (材料の表 を参照してください)。前に、断面を固める接着剤のための十分な時間を許可します。 転送 vibratome バッファー トレイに試料ホルダーで脳が満たされた PBS。100 μ m の脳のスライス (矢状またはコロナ) をセクションに、vibratome を使用します。以前満ちている PBS 6 ウェル プレートの脳のセクションを収集します。 脳断面仕上げ、時に慎重に PBS を削除し、PBS/グリセロールの 1:1 のソリューションに置き換える。 -20 PBS/グリセリン セクションに格納 ° C 2。細胞や細胞小器官が蛍光染色によるラベリング 慎重に転送脳セクション 24 ウェル プレートのウェルに以前満ちて PBS の 500 μ L/ウェル。プロシージャの終わりまでセクションで、同じのままになります。 すすぎ PBS の穏やかな動揺の下で 5 分間 500 μ L で 2 回セクション。 同時ブロックと脳スライスの透過を行い、PBS を削除します。 PBS の 準備 0.3% とブロックと透過ソリューション トリトン X と 10% ロバ血清 。 注: ロバ血清は、使用される特定の二次抗体のホスト種に合わせてヤギ血清と置き換えることができます。 の穏やかな動揺の下で室温で 1 時間ブロッキングと透過ソリューションの 250 μ L でセクションをインキュベートします。 ソリューションを削除し、5% ロバ血清と (例えば 1:1, 000、1: 100) 適切な希釈で一次抗体を含む PBS 溶液を追加。穏やかな攪拌下の 4 ° C で一晩インキュベートします 。 注: は、正常にこのプロトコルで NVU の異なった細胞のタイプをラベル抗体のリストのための 材料表 を参照してください。一次抗体の希釈は経験的に決定する必要があります。異なった抗原の同時表示の同じソリューション内のすべての一次抗体を希釈します。すべて一次抗体は種で発生する必要があります。抗体の浸透を高めるためには、サンプルが 4 で最大 72 時間培養することができます ° C 削除抗体ソリューション、洗うのためのセクション 3 回室温で穏やかな動揺の下で PBS で 10 分。PBS を削除し、250 μ L の PBS ソリューション含む 5% ロバ血清および適切な特異的蛍光標識二次抗体を追加します。穏やかな動揺の下で 1 時間室温でインキュベートします。 このプロトコルと共に使用される二次抗体のリストの 材料表 を参照してください。 室温で穏やかな動揺の下で PBS で 10 分間 3 回抗体ソリューションおよび洗浄セクションを削除します。 PBS を削除し、4 の 250 μ L を追加 '、最終濃度 1 μ G/ml と 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ソリューション。室温でのセクション穏やかな動揺の下で 10 分間インキュベートします。PBS で 5 分間 3 回 DAPI ソリューションおよび洗浄のセクションを削除します。 は、顕微鏡のスライド (例えば、 病理組織接着ガラス スライド) を接合部に及ぼす脳セクションをマウントします。スライドのセクションの周囲の余分な PBS を慎重に取り外します。メディアをマウントのドロップを追加 (材料の表を参照) 上の脳のセクションと慎重に 0.17 mm (1.5 号) ホウケイ酸ガラス基板にかぶせて。 画像集録を実行するまでの光から保護 4 ° c のサンプルを格納します。 3。血液-脳関門の高分解能共焦点イメージング 実行画像集録適切なレーザ走査共焦点顕微鏡 (材料表 参照) 405、488、561、633 のレーザー ラインと nm の励起光のスペクトルの青、緑、オレンジ、赤の領域の fluorophores が付いています。画像を取得する 1.4 の開口を持つ石油目的 X 63 を使用します。 買収で顕微鏡を制御するソフトウェアのメニューが画像に集録パラメーターを設定します。ドロップ ダウン メニューで ‘ イメージ サイズ ’、1024 x 1024 ピクセルの値を選択します。ピクセル サイズの値を調整することにより 200 と 300 nm の間の値を変更、‘ ズーム ’ メニュー ” 注: 細胞内構造物の解析、75 ピクセル サイズを減らす nm。この画像サイズ設定は実質的に取得時間が長くなります、狭い視野をイメージングによる取得時間を短縮する 512 × 512 ピクセルに縮小することができます。 で、' 集録速度 ' ドロップ ダウン メニュー、すなわち 400 行毎秒 400 Hz の値を選択します。' のシステム設定・ #39;メニュー、選択、' ピクセル深度 ' ドロップ ダウン メニュー、および 12 ビットに値を変更します。 顕微鏡ソフトウェアの内、' 買収 ' タブ、連続フレーム獲得のためのオプションの切り替え。0.75 から各チャンネルの 1 μ m の値の値を変更することにより光学切片厚を設定します ' ピンホール ' メニュー。 蛍光励起用パネルでアクティブ レーザーを最適刺激サンプル、緑色発光蛍光体のたとえば 488 nm レーザー ラインでフルオロ 。 注: 蛍光スペクトルのビューアーを使用して、(参照 材料表) 十分な励起レーザーを選択します。 蛍光検出のパネルで 510 と 550 nm 緑色発光蛍光体の間など、各チャンネルで測定される波長を選択するスライダーに移動します 。 注: 蛍光スペクトルのビューアーを使用して、(参照 材料表) 十分な検出波長を選択します。 は屈折率ガラス基板と目的の屈折を一致するように脳断面 coverslip の上に 1.52 とイマージョン オイルの滴を追加します。顕微鏡でサンプルを置き、顕微鏡双眼鏡を使用してサンプルを視覚化する epifluorescent ランプをオンにします。 核を DAPI 染色を可視化する適切なフィルターを選択するフィルター ホイールを変更顕微鏡スタンドのボタンを使用します。フォーカスに核を DAPI 染色から信号を持って来る粗フォーカスを使用します。 (例えば、CollagenIV または CD31) 血管マーカーからの信号を視覚化し、個々 の毛細血管セグメントのビューのフィールドを中心にフィルターを変更して顕微鏡スタンドのボタンを使用します。 は、ライブ スキャン ・ モードを開始するボタンを押します。スキャン中に画像のダイナミック レンジを最大化し、ピクセル飽和を避けるために各チャンネルのゲインとレーザーの強度を調整します 。 注: は、白とびを視覚的に評価するために飽和ピクセルを分類するルックアップ テーブルを使用します。信号の白とびを避けるためには、最高の蛍光信号があると予想されるサンプルの設定を調整します。 が 2 に平均線の値を設定します 。 注: 高い集録速度を使用している場合は、ノイズを低減するこの値を大ききます。 を確立する開始し、毛細血管の全体ボリュームをスパンする光の z スタックを実行するためのセクションを終了します。0.45 μ m のステップ サイズを使用します 。 注: 画像は、後続の定量化に使用される場合、保つ完全なデータのセットに同じ取得設定します。 定量化, 統計上の比較のために少なくとも 3 つの別のマウスからセクションあたり 10 に 20 z スタックを取得します 。 注: サンプルの漂白とレーザー強度の変動から生じる変動を減らすために同じセッションで、完全なデータ セットを取得します。 4。画像単位の処理および 3 D 再構成 取得した z スタックの軸の解像度を上げる、適切なソフトウェアを使用してイメージ データ セットのデコンボリューションを実行する (省略可能) (材料表を参照してください。). デコンボリューション ソフトウェアで実行する設定を変更 " ブラインド " デコンボリューション (すなわち、適応の点広がり関数を使用). デコンボリューション ソフトウェアの設定、背景の削除のためのオプションの切り替えでこのオプションは画像のスタックの最小強度値を確認し、イメージのすべてのピクセルから強度の値から減算します。 強度を再スケーリングのためのオプションをオフを切り替えるデコンボリューション ソフトウェアの設定で、16 ビット深度にサイズを変更するこれらのオプションは、元の照度値と画像のダイナミック レンジにいきます。 のメニューで ' 屈折率 '、1.52 に値を設定します。' 設定波長 ' メニュー、選択画像の各チャンネルの値を放出。たとえば、緑色発光蛍光体の 520 を選択します。 可視化と解析 (材料の表 を参照してください) 3 次元のデータ セットに適したソフトウェアを使用してイメージ データ セットを開きます。画像解析ソフトウェアでを押して、" 越え " 毛細血管の 3D ボリュームを表示するボタンです。 画像解析ソフトウェア プレス 、" 追加新しい表面 " 毛管表面をセグメントします。下の矢印を使用して、サーフェスの作成ウィザードの手順間を移動する。 で、' 作成 ' tab キー、キャピラリー マーカーで、たとえば CollagenIV、チャネルに送信元チャネルを設定し、表面積詳細を 0.5 μ m の値に設定します 。 注: 後者のオプション ガウス フィルターを画像に適用し、表面の滑らかさが決まります。 で、' 作成 ' 絶対輝度しきい値のオプションの切り替えタブ 。 注: このオプションは、イメージ内の選択したチャネルの絶対的な強度に基づいてマスクを生成することによってサーフェスを作成します。 サーフェスの作成ウィザードの次の手順にレンダリングされたマスクは、画像全体の毛細血管をカバーするまで、全体の輝度のヒストグラム スライディング ウィンドウを移動することによって表面の低輝度しきい値を調整します。各データの経験的このパラメーターの値の範囲を決定します。 のドロップ ダウン メニューをクリックしてサーフェス作成ウィザードの最後のステップで " フィルターの種類 " オプションを選択 ' ボクセル数 '。2.0e5 に 1.0e5 の間の値にボクセルの最小数を設定します 。 注: このオプションは、ボクセル、フレームの端に毛細血管などの小さなセグメントの数が少ないとサーフェスが除外されます。 サーフェスの作成ウィザードを終了し、クリックして作成パラメーターを保存 " パラメーターを覚えて " 表面のメニューの [再構築] タブにします。 は、最初の画像に使用するパラメーター セットをロードすることによってデータ セットを画像全体の手順を繰り返します。強度、しきい値、およびバック グラウンド強度と毛細血管の形態の違いをアカウントに各イメージのボクセルの最小数のパラメーターをそれぞれ調整します。 細胞内小胞の構造 (例えば、免疫グロブリンいっぱいエンドソーム) のセグメントは、最初だけ毛細血管内から蛍光信号が含まれている新しいチャネルを作成します 。 注: このプロセスは 4.3 選択のステップで作成した毛細血管の表面を使用してマスクを作成することによって関心の領域を定義が、' 編集 ' のメニュー、' 毛管表面 ' パネル。下で ' プロパティをマスク ' をクリックして " マスクすべて "。細胞内小胞信号を含むチャンネルを選択、' ソース チャンネル ' とオプションの切り替え " マスクを適用する前にチャンネルを複製 ". で、' マスク設定 ' 列、選択 " 定数内/外 " と " 外表面ボクセルを設定: " その値を 0.00 に設定と 。 注: 毛細血管マスク外のすべての画素が 0 の強度の値を持つイメージに追加のチャネルは、このプロセスが作成されます。定量化 (すなわち、脳実質の) 毛細血管外イベント、選択 " 内面にボクセルを設定: " しその値を 0.00 に設定します。 小胞構造をセグメント、開始ボタンを押して、" の新しいスポットを追加 " ウィザード。下の矢印を使用して、サーフェスの作成ウィザードの手順間を移動する。 [作成] タブのドロップ ダウン メニューの下でを使用して、" ソース チャンネル " 4.4.4 のステップで作成した細胞内マスク チャネルを選択します。 [作成] タブの下で、" スポットの検出 " セクションで、0.5 ~ 1 μ m で観察された小胞の平均サイズに応じて値を推定 XY 直径を設定実験。このオプションは、分割アルゴリズムによって検出される最小のサイズを決定します。 [作成] タブの下で、" スポットの検出 "] セクションで、オプションの切り替え " 背景差分 ". 注: このオプション (4.4.7 のステップで選択した値) からスポット半径を 0.75 のガウス フィルター画像を滑らか、そして 0.88 スポット半径でフィルタ リング、ガウスの元のイメージの強さを引いています。 で、' 作成 '] タブで、下のドロップ ダウン メニューを押して ' フィルターの種類 ' を選択、" 品質 "。観光スポットの中心での強度に基づいてしきい値を適用することによってイメージをセグメントはこれに注意してください。スライディング窓の向こうを動かして低輝度しきい値を調整、' 品質 ' ヒストグラムまで識別可能な小胞の大半がラベル付けされます 。 注: このパラメーターの値の範囲は、各データ セットに対して経験的に決定する必要があります。 スポット作成ウィザードを終了し、ボタンを押すと作成パラメーターを保存 " パラメーターを覚えて " 表面のメニューの [再構築] タブにします。 は、最初の画像に使用するパラメーター セットをロードすることによってデータ セットを画像全体の手順を繰り返します。パラメーターを調整、' 品質輝度しきい値 ' 各イメージ背景強度の違いを考慮する。 5。BBB で細胞内輸送の定量化 (μ m 3) の体積とキャピラリーのセグメントの (μ 2) の面積を定量化します。解析ソフトウェアで血管で 4.3 の手順で作成したサーフェスの [統計] パネルにアクセスします。選択、' 詳細 '] タブをクリックし、ドロップ ダウン メニューを使用して選択します " すべての値 " 体積と面積の値を検索する。 は、キャピラリーのセグメント内の小胞の数を定量化します。解析ソフトウェアで 4.4 のステップで作成したスポットの [統計] パネルにアクセスします。選択、' 全体 ' イメージのスポットの合計数の値を検索するタブです。 イメージごとの細孔容積あたりの小胞の数を計算する は、ステップ 5.1 で計算されたボリュームでスポットの数を正規化します。この値を掛ける 1,000 あたり 1,000 μ m 3 細孔容積の小胞の数を取得します。 毛細血管内の総強度を定量化する は、全体のイメージ次の手順 4.3 次の変更で説明されている指示をカバーする新しいサーフェスを作成します。ソース チャネルとして適切な信号 (例えば mIgG) を含むチャンネルを選択し、表面積の詳細レベルの値を 5 μ m に設定。画像全体をカバーするサーフェスを作成する低輝度しきい値の値を 0 に設定します。 解析ソフトウェアでは 5.4 の手順で作成されたサーフェスの [統計] パネルにアクセスします。選択、" 詳細 "] タブをクリックし、ドロップ ダウン メニューを使用して選択します " すべての値 "。値を記録 ' 強度の合計 ' の利益のチャネルのこのパラメーターは、すべてのピクセルで個々 の強さの値の合計に相当します 。 注: 細胞内信号のためこれは 0.0 に設定画面の外側のボクセルと重複したチャネルに対応します。脳実質内の信号、この内面は 0.0 に設定ボクセルと重複したチャネルに対応します。 イメージごとの細孔容積あたりの蛍光強度を計算する は、ステップ 5.1 で計算された量で強度を標準化します。1,000 人あたり 1,000 μ m 3 細孔容積の蛍光強度値を取得するこの値を乗算します 。 注: 脳実質の蛍光信号の細孔容積を差し引いた合計画像ボリュームを正規化して脳実質の 1,000 μ m 3 あたり全磁力を得るため 1,000 を掛けます。 データセット全体に対して手順を繰り返し、適切なソフトウェアを使用して、データの統計分析を実行します。