Imagerie confocale à haute résolution de la barrière hémato - encéphalique : imagerie, Reconstruction 3D et la Quantification de la transcytose

approbation déontologique pour cette étude a été fournie par le Federal Food Safety and Office vétérinaire de la Suisse. Toutes les expériences sur des animaux ont été menées dans le strict respect de l’ordonnance sur la protection animale et le bien-être, ainsi que selon les règles de l’Association pour l’évaluation et l’accréditation du laboratoire Animal Care International (AAALAC). 1. génération de cerveau mobiles Sections pour assurer une qualité optimale d’échantillon, préparer une nouvelle solution de 2 % de paraformaldéhyde (PFA) dans une solution saline tampon de phosphate (PBS) le jour de la perfusion de. ATTENTION : PFA est modérément toxique par contact avec la peau et probablement cancérogène. Gants en nitrile permet de gérer la PFA et de préparer la solution sous une hotte chimique. Préparer 60 mL de solution PFA par animal. Bring PFA en solution en augmentant le pH à 180-200 µL d’une solution KOH de 5 M pour chaque 100 mL de PBS et de chauffage de la solution jusqu’à 60 ° C. NOTE : NaOH ne doit pas être utilisé car elle influence négativement préservation des tissus lors de la fixation. Laisser refroidir les solution à température ambiante et amener le pH à 7.4 à l’aide de HCl filtrer la solution à l’aide de papier filtre (voir la Table des matières). Effectuer une fixation toute souris par perfusion de transcardial comme décrit précédemment 15 avec quelques modifications. Tout d’abord, rincer le sang de la vascularisation avec 20 mL de PBS puis perfuse avec 40 mL de 2 % PFA. Enlever le cerveau du crâne comme décrit précédemment 15. Plonger un fraîchement 2 % PFA et sous perfusion cérébrale dans 20 mL de 2 % PFA pendant 7 h à 4 ° C d’après fixation. NOTE : Augmenter l’incubation en PFA est déconseillée car elle peut empêcher la détection des structures intracellulaires. Abondamment laver le cerveau avec du PBS glacee. Embed fixé des cerveaux dans l’agarose. Préparer un gel d’agarose 3 % solution de PBS à l’aide d’un four à micro-ondes pour le chauffage. Agiter doucement la solution pour refroidir mais éviter de solidification. Sécher l’excès de PBS autour du cerveau avant l’immersion dans la solution de gel d’agarose dans un récipient en plastique. Faire pivoter le cerveau à l’intérieur de l’agarose pour enlever les bulles d’air. Permettre l’agarose à se solidifier en refroidissant sur glace Retirer le bloc d’agarose dans le conteneur en plastique soigneusement et couper un cube autour du cerveau à l’aide d’une lame de rasoir. Monter le cerveau sur un porte-échantillon vibratome (voir Table des matières) à l’aide de colle cyanoacrylate (voir Table des matières). Prévoir un délai suffisant pour la colle se solidifie avant de procéder à la découpe. Transfert le cerveau dans le porte-échantillon dans le plateau de tampon vibratome rempli avec du PBS. Utilisez le vibratome à l’article coupes de cerveau de 100 µm (sagittales ou coronales). Recueillir des sections de cerveau dans une plaque de 6 puits précédemment rempli de PBS. Dès la finition de cerveau de sectionnement, soigneusement sortir PBS et les remplacer par une solution de 1:1 de PBS/glycérol. Conserver les sections en PBS/glycérol à -20 ° C. 2. Cellules ou organites étiquetage par Immunofluorescence souillant soigneusement transfert une partie du cerveau dans un puits d’une plaque 24 puits rempli précédemment avec 500 µL de PBS / puits. La section restera dans le même puits jusqu’à la fin de la procédure. Rincer la section deux fois avec 500 µL de PBS pendant 5 min sous agitation modérée. Enlever le PBS et effectuer le blocage simultané et perméabilisation des tranches de cerveau. Préparer une solution de blocage et la perméabilisation avec 0,3 % le sérum âne Triton-X et 10 % dans du PBS. NOTE : Sérum de l’âne peut être remplacé par sérum de chèvre pour correspondre à l’espèce hôte spécifique anticorps secondaire utilisé. Incuber des sections avec 250 µL de solution de blocage et de perméabilisation pendant 1 h à température ambiante sous agitation modérée. Enlever la solution et ajouter une solution de PBS contenant 5 % de sérum d’âne et l’anticorps primaire à une dilution appropriée (p. ex., 1/100 à 1 / 1 000). Incuber une nuit à 4 ° C sous agitation modérée. Remarque : Consultez la Table des matières pour obtenir une liste des anticorps qui étiquette avec succès les différents types cellulaires de l’UNV avec ce protocole. La dilution optimale des anticorps primaires doit être déterminée empiriquement. Pour un étiquetage simultanée des antigènes différents, diluer tous les anticorps primaires dans la même solution. Tous les anticorps primaires doivent être déclenchés dans différentes espèces. Pour améliorer la pénétration de l’anticorps, des échantillons peuvent être incubés jusqu’à 72 h à 4 ° C. Remove anticorps solution lavage sections et trois fois pendant 10 min dans du PBS sous agitation modérée à température ambiante. Retirez les PBS et ajouter 250 µL PBS solution contenant 5 % âne du sérum et l’anticorps secondaire au fluorescent étiquetés spécifiques appropriées. Incuber les sections à température ambiante pendant 1 h sous agitation modérée. Voir la Table des matières liste des anticorps secondaires utilisés avec ce protocole. Supprimer les sections de solution et lavage des anticorps trois fois pendant 10 min dans du PBS sous agitation modérée à température ambiante. PBS de supprimer et ajouter 250 µL d’un 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) solution avec une concentration finale de 1 µg/mL. Incuber les sections à température ambiante pendant 10 minutes sous agitation modérée. Retirer les sections de solution et lavage DAPI 3 fois pendant 5 min avec du PBS. Monter la section du cerveau sur le collage des lames de microscope (p. ex., les lames de verre histo-bond). Retirez soigneusement les PBS excès autour de la section sur la diapositive. Ajouter une goutte de milieu de montage (voir Table des matières) sur le dessus de la section de cerveau et soigneusement le couvrir avec une lamelle de verre borosilicaté de 0,17 mm (n ° 1,5). Conserver les échantillons à 4 ° C, abri de la lumière jusqu’à l’exécutant de l’acquisition de l’image. 3. Imagerie confocale à haute résolution de la barrière hémato – encéphalique microscope confocal Perform acquisition d’images avec un laser à balayage adapté (voir Table des matières) avec lignes laser à 405, 488, 561 et 633 nm pour l’excitation des fluorophores dans les régions de bleues, vertes, orange et rouges du spectre lumineux. Pour l’acquisition de l’image, utilisez un 63 X objectif à huile avec une ouverture numérique de 1,4. Dans le cadre de l’acquisition, le menu du logiciel qui contrôle le microscope, définir l’image paramètres d’acquisition. Dans le menu déroulant de ‘ taille de l’Image ’, sélectionnez une valeur de 1024 x 1024 pixels. Modifier la taille du pixel à une valeur comprise entre 200 et 300 nm en ajustant la valeur de la ‘ Zoom ’ menu. ” Remarque : pour l’analyse des structures intracellulaires, réduire la taille du pixel à 75 nm. Ce paramètre de taille d’image sensiblement augmente le temps d’acquisition et peut être réduit à 512 x 512 pixels pour diminuer le temps d’acquisition par un petit champ de vision d’imagerie. Dans la ' vitesse d’Acquisition ' menu déroulant, sélectionnez une valeur de 400 Hz, c’est-à-dire 400 lignes par seconde. Dans le ' paramètres systèmes & #39; menu, sélectionnez le ' Echantillonnage ' du menu déroulant, puis changez la valeur en 12 bits. Dans le logiciel de microscope, au sein de la ' acquisition ' onglet, activer/désactiver l’option pour l’acquisition de trame séquentielle. Définir l’épaisseur de coupe optique à une valeur comprise entre 0,75 et 1 µm pour chaque canal en modifiant la valeur dans la ' trou d’épingle ' menu. Dans le panneau pour l’excitation fluorescente, activer le laser pour mieux exciter les fluorophores dans l’échantillon, par exemple 488 nm laser ligne pour un fluorophore émettant vert. Remarque : Utilisez une visionneuse de spectres fluorophore (voir Table des matières) pour sélectionner le laser d’excitation suffisante. Dans le panneau pour détection par fluorescence, déplacez le curseur pour sélectionner les longueurs d’onde qui se mesurera dans chaque canal, par exemple entre 510 et 550 nm pour un fluorophore émettant vert. Remarque : Utilisez une visionneuse de spectres fluorophore (voir Table des matières) pour sélectionner les longueurs d’onde de détection adéquats. Ajouter une goutte d’huile à immersion avec un indice de réfraction de 1,52 sur le dessus de la lamelle avec la section du cerveau en fonction de l’indice de réfraction du verre couvre-objet et objectif. Placer l’échantillon dans le microscope et allumez la lampe épifluorescence pour visualiser l’exemple à l’aide de jumelles microscope. En utilisant les boutons sur le statif, changer la roue de filtre pour sélectionner un filtre approprié pour la visualisation de noyaux colorés au DAPI. L’accent grossier permet de mettre le signal des noyaux colorés au DAPI focus sur. En utilisant les boutons sur le statif, changer les filtres de visualiser le signal à partir des marqueurs vasculaires (par exemple, CollagenIV ou CD31) et centrer le champ de vision sur un segment capillaire. Appuyez sur le bouton pour lancer le mode balayage direct. Lors de la numérisation, réglez l’intensité de laser et de gain pour chaque canal afin de maximiser la plage dynamique des images et éviter la saturation des pixels. Remarque : Utiliser une table de correspondance qui étiquète saturés pixels pour évaluer visuellement la sursaturation. Pour éviter la sursaturation signal, ajustez les réglages à l’échantillon qui est censé avoir le plus haut signal fluorescent. Définir la valeur de ligne avec une moyenne de 2. Remarque : Lorsque vous utilisez des vitesses plus élevées acquisition, augmentez cette valeur pour réduire le bruit. Établir commence et termine les sections pour l’exécution optiques z-piles qui s’étendent sur l’ensemble du volume du capillaire. Utilisez une taille d’étape de 0,45 µm. Remarque : Si des images seront utilisés pour la quantification ultérieure, conserver les mêmes paramètres d’acquisition pour l’ensemble de données complet. Pour la quantification, acquérir z-piles de 10 à 20 par section d’au moins trois différentes souris pour les comparaisons statistiques. NOTE : Acquérir l’ensemble de données complet dans la même session de réduire la variabilité découlant des fluctuations d’intensité de blanchissement et laser échantillon. 4. Image Processing Reconstruction 3D de l’unité neurovasculaire (facultatif) pour augmenter la résolution axiale des z-piles acquises, effectuer la déconvolution de l’ensemble de données d’images à l’aide des logiciels appropriés (voir Table des matières ). Dans le logiciel de déconvolution, modifiez les paramètres pour effectuer " aveugle " déconvolution, (c’est-à-dire, en utilisant une fonction de point-diffusion adaptative). Dans les paramètres de logiciel de déconvolution, activer/désactiver l’option pour l’élimination de l’arrière-plan ; cette option va déterminer la plus petite valeur de l’intensité dans la pile d’image et il en soustraire les valeurs d’intensité de tous les pixels de l’image. Dans les paramètres de logiciel de déconvolution, désactiver les options de redimensionnement d’intensité et de redimensionnement à 16 bits de profondeur ; ces options conservera les valeurs d’intensité origine et la plage dynamique des images. Dans le menu du ' l’indice de réfraction ', définissez la valeur sur 1,52. Dans le ' définir la longueur d’onde ' menu, sélectionnez l’émission de valeurs pour chaque canal de l’image. Par exemple, sélectionnez 520 pour un fluorophore émettant vert. Ouvrir le jeu de données d’image à l’aide de logiciels adaptés pour la visualisation et l’analyse des ensembles de données 3-dimensionnelle (voir Table des matières). Dans le logiciel d’analyse de l’image, appuyez sur la " Surpass " bouton pour restituer le volume 3D de capillaires. Dans la presse de logiciel image analyse la " Ajouter Nouvelle surface " bouton pour segmenter la surface capillaire. Utilisez les flèches bas pour vous déplacer entre les étapes de l’Assistant de création de surface. Dans la ' Create ' onglet, régler le canal de la source à la chaîne avec le marqueur capillaire, par exemple CollagenIV et définir le détail de l’aire de la surface d’une valeur de 0,5 µm. Remarque : Cette dernière option applique un filtre gaussien à l’image et détermine la finesse de la surface. Dans les ' créer ' onglet, activer/désactiver l’option pour le seuil d’intensité absolue. Remarque : Cette option crée une surface en générant un masque basé sur l’intensité absolue de la chaîne sélectionnée dans l’image. Sur la prochaine étape de l’Assistant de création de surface, ajuster le seuil d’intensité pour la surface en déplaçant la fenêtre coulissante sur l’histogramme d’intensité jusqu’à ce que le masque rendu couvre le capillaire entier dans l’image. Déterminer la plage de valeurs pour ce paramètre empirique pour chaque ensemble de données. Lors de la dernière étape de l’Assistant de création de surface, cliquez sur le menu déroulant sous " filtre Type " et sélectionnez l’option ' nombre de Voxels '. Définit le nombre minimal de voxels sur une valeur comprise entre 1.0e5 à 2.0e5. Remarque : Cette option exclura les surfaces avec un petit nombre de voxels, par exemple, de petits segments de capillaires au bord de l’armature. Terminez l’Assistant de création de surface et d’enregistrer les paramètres de création en cliquant sur " n’oubliez pas de paramètres " dans l’onglet de la reconstruction du menu surface. Répéter la procédure pour l’ensemble de jeu de données d’imagerie en chargeant le jeu de paramètres utilisé pour la première image. Ajustez les paramètres pour l’intensité, le seuil et le nombre minimum de voxels pour chaque image à tenir compte des différences dans l’intensité de l’arrière-plan et morphologie capillaire, respectivement. Au segment des structures vésiculaires intracellulaires (par exemple, rempli d’immunoglobuline endosomes), tout d’abord créer un nouveau canal qui inclut uniquement un signal fluorescent de dans le capillaire. Remarque : Ce processus définira une région d’intérêt en créant un masque à l’aide de la surface capillaire, créée à l’étape 4.3 Sélectionnez le ' edit ' menu dans la ' surface capillaire ' panneau. Sous ' masquer les propriétés ', cliquez " masque tous les ". Sélectionnez la chaîne qui contient le signal de vésicules intracellulaires comme les ' Source canal ' et bascule sur l’option " dupliquer le canal avant d’appliquer le masque ". Dans la ' masquer les paramètres ' colonne, sélectionnez " constante à l’intérieur/extérieur " et " voxels en dehors de la surface à la valeur : " et affectez-lui la valeur 0,00. Remarque : Ce processus va créer un canal supplémentaire de l’image où tous les voxels en dehors du masque capillaire aura une valeur d’intensité de 0. Pour quantifier les événements en dehors de la capillaire (c’est-à-dire, dans le parenchyme du cerveau), choisissez " voxels à l’intérieur de la surface à la valeur : " et affectez-lui la valeur 0,00. à segmenter les structures vésiculaires, appuyez sur le bouton pour démarrer la " ajouter de nouveaux Spots " Assistant. Utilisez les flèches bas pour vous déplacer entre les étapes de l’Assistant de création de surface. Dans l’onglet créer, utilisez le menu déroulant sous " Source canal " pour sélectionner le canal masqué intracellulaire, créé à l’étape 4.4.4. Dans l’onglet créer, dans le " Spot detection " section, d’une valeur comprise entre 0,5 et 1 µm, selon la taille moyenne des vésicules observée dans la valeur du diamètre estimé de XY l’expérience. Cette option détermine la plus petite taille qui sera détectée par l’algorithme de segmentation. Dans l’onglet créer, dans le " Spot detection " section, activer/désactiver l’option pour " fond soustraction ". Remarque : Cette option va lisser l’image avec un filtre gaussien de 0,75 rayon spot (à partir de la valeur sélectionnée à l’étape 4.4.7) et puis en soustrayant l’intensité de l’image originale gaussienne filtrée par rayon spot 0.88. Dans les ' créer ' l’onglet, appuyez sur le menu déroulant sous ' filtre Type ' et sélectionnez " qualité ". Notez que ceci va segmenter l’image par l’application des seuils basés sur l’intensité au centre des taches. Réglez le seuil d’intensité en déplaçant la fenêtre coulissante à travers la ' qualité ' histogramme jusqu’à ce que la majorité des vésicules identifiables est étiquetée. Remarque : La plage de valeurs pour ce paramètre doit être déterminées empiriquement pour chaque ensemble de données. Terminez l’Assistant de création de spot et enregistrer les paramètres de création en appuyant sur le bouton " n’oubliez pas de paramètres " dans l’onglet de la reconstruction du menu surface. Répéter la procédure pour l’ensemble de jeu de données d’imagerie en chargeant le jeu de paramètres utilisé pour la première image. Ajustez les paramètres pour la ' seuil d’intensité de qualité ' pour chaque image tenir compte des différences dans l’intensité de l’arrière-plan. 5. Quantification du Transport intracellulaire à la BHE quantifier le volume (en µm 3) et la zone (µm 2) du segment capillaire. Dans le logiciel d’analyse, accéder au panneau de statistiques de l’aire vasculaire créé à l’étape 4.3. Sélectionnez le ' Detailed ' onglet, puis utilisez le menu déroulant pour sélectionner " toutes les valeurs " pour trouver les valeurs de volume et de la zone. Quantifier le nombre de vésicules dans le segment des capillaire. Dans le logiciel d’analyse, accéder au panneau de statistiques des taches créé à l’étape 4.4. Sélectionnez le ' globale ' onglet pour trouver la valeur du nombre total de points dans l’image. Pour calculer le nombre de vésicules par volume capillaire, pour chaque image de normaliser le nombre de places par le volume calculé à l’étape 5.1. Multipliez cette valeur par 1 000 pour obtenir le nombre de vésicules par 1 000 µm 3 du volume capillaire. Pour quantifier l’intensité totale dans le capillaire crée une surface qui couvre ce qui suit une image toute les instructions décrites dans les étapes 4.3 avec les modifications suivantes. Sélectionnez la chaîne qui contient le signal pertinent (p. ex., mIgG) comme canal source et définissez la valeur du niveau de détail de la superficie à 5 µm. Pour créer une surface qui couvre l’ensemble de l’image, définissez la valeur du seuil plus faible intensité 0. Dans le logiciel d’analyse, accéder au panneau de statistiques de la surface créée à l’étape 5.4. Sélectionnez le " Detailed " onglet, puis utilisez le menu déroulant pour sélectionner " toutes les valeurs ". Enregistrez les valeurs pour ' intensité somme ' pour les canaux d’intérêt ; ce paramètre correspond à la somme des valeurs d’intensité différentes pour tous les pixels. Remarque : Pour un signal intracellulaire, cela correspond au canal dupliqué avec voxels en dehors de la surface de la valeur 0.0. Pour un signal dans le parenchyme du cerveau, ce qui correspond au canal dupliqué avec voxels à l’intérieur de la surface de la valeur 0.0. Pour calculer l’intensité de fluorescence par volume capillaire, pour chaque image de normaliser l’intensité par le volume calculé à l’étape 5.1. Multipliez cette valeur par 1 000 pour obtenir la valeur d’intensité de fluorescence par 1 000 µm 3 du volume capillaire. Remarque : Pour les signaux fluorescents dans le parenchyme du cerveau, normaliser les valeurs par le volume de l’image totale moins le volume capillaire et multiplier par 1000 pour obtenir l’intensité totale par 1 000 µm 3 du parenchyme cerveau. Répéter la procédure pour l’ensemble des données et utiliser un logiciel approprié pour effectuer une analyse statistique des données.