Biblioteca de peptídeo sobreposição para mapear os resumos de Qa-1 em uma proteína
Summary
QA-1 (HLA-E em humanos) pertence a um grupo de moléculas de 1b complexo principal de histocompatibilidade não-clássica. Imunização com resumos de Qa-1-ligação foi mostrada para aumentar o tecido-específica Regulamento imune e amenizar várias doenças auto-imunes. Neste documento descrevemos uma estratégia de biblioteca de peptídeo sobreposição para a identificação de epitopos de Qa-1 em uma proteína.
Abstract
QA-1 (HLA-E em humanos) pertence a um grupo de não-clássica histocompatibilidade complexa 1b moléculas (MHC-Ib). Dados recentes sugerem que as moléculas de Qa-1 desempenham papéis importantes em Agrimensura células para integridade estrutural e funcional, induzindo o Regulamento imune e limitando a resposta imune a infecções virais. Além disso, funcional aumento de CD8 Qa-1-restrito+ T células através do epítopo imunização tem mostrado efeitos terapêuticos em vários modelos animais doença auto-imune, por exemplo, experimental encefalomielite alérgica, artrite induzida por colágeno e diabetes não-obesos. Portanto, há uma necessidade urgente de um método que pode eficientemente e rapidamente identificar epítopos de Qa-1 funcionais em uma proteína. Aqui, descrevemos um protocolo que utiliza o CD8 Qa-1-restrito+ célula T linhas específicas para uma biblioteca de peptídeo (OLP) sobrepostas para determinar os resumos de Qa-1 em uma proteína. Esta biblioteca OLP contém 15-mer sobreposição peptídeos que cobrem todo o comprimento de uma proteína, e peptídeos adjacentes se sobrepõem por 11 aminoácidos. Usando este protocolo, identificamos recentemente um epítopo de Qa-1 9-mer em glicoproteína oligodendrocyte de mielina (MOG). Este recém mapeada epítopo MOG Qa-1 foi mostrado para induzir CD8 epítopo específico, Qa-1-restrito+ T células desse regulamento imune reforçado de mielina específicos. Portanto, o presente protocolo é útil para futura investigação de novos objectivos e funções de CD8 Qa-1-restrito+ T células.
Introduction
QA-1 pertence a um grupo de não-clássica histocompatibilidade complexa 1b moléculas (MHC-Ib) em camundongos. Seu homólogo humano é HLA-E. Provas anteriores tem demonstrou que as moléculas de Qa-1 tem importantes funções biológicas. Em primeiro lugar, Qa-1 moléculas desempenham um papel importante no levantamento de células para a integridade estrutural e funcional. Neste aspecto, Qa-1 moléculas evoluíram diversas estratégias para monitorar a função normal de uma célula. Uma tal estratégia permite Qa-1 moléculas para formar complexos com um peptídeo líder transformados (epítopo), ou seja, o Qa-1 determinante modificador (Qdm) é processado a partir de moléculas de MHC-i clássicas no retículo endoplasmático1. Estes complexos de Qa-1/Qdm depois exibir na superfície de uma célula e ligam aos receptores inibitórios de NKG2A em células NK para inibir NK matar atividade2. Se a expressão de moléculas de MHC-i é perdida, uma célula (por exemplo, uma célula maligna) torna-se sensível para NK matar2. A outra estratégia permite Qa-1 moléculas formar novos complexos de Qa-1/epítopo na superfície de uma célula que é deficiente em TAP (transporte associado ao processamento de antígeno)3 e/ou ERAAP (retículo endoplasmático aminopeptidase associado processamento do antígeno)4 (ambas as deficiências muitas vezes ocorrem em células malignas). A célula que expressa estes novos complexos de Qa-1/epítopo pode ser reconhecida e eliminada pelo epítopo específico CD8 Qa-1-restrito+ T células. Em segundo lugar, moléculas de Qa-1 induzem Regulamento imune5. Neste aspecto, Qa-1/epítopo complexos têm sido mostrados para estimular CD8+ pilhas de T (Treg) reguladoras que são importantes para a prevenção do dano imune-mediada de autotecidos6,7,8 ,9,10. Em terceiro lugar, CD8 Qa-1-restrito+ Treg células têm sido mostradas para limitar as respostas imunes contra infecção viral11.
Portanto, aumento do específico do epítopo específico CD8 de Qa-1-restrictred+ T células é uma estratégia potencialmente promissora para a eliminação de células anormais, para o aprimoramento do Regulamento imune e para o controle da magnitude do induzida por vírus respostas imunes. Enquanto não tiver sido determinado se aumento de epítopo específico CD8 Qa-1-restrito+ T células podem reforçar a vigilância imunológica e limitar as respostas de imune induzida por vírus, nossos laboratórios e outros demonstraram claramente que imunização com resumos de Qa-1 pode aumentar a função de Qa-1-restrito CD8+ Treg células específicas para CD4 auto-imune patogénicos+ T células, levando ao controle eficiente de CD4+ doenças auto-imune mediada por células T em um variedade de animal modelos tais como encefalomielite alérgica experimental (um modelo animal do humano esclerose múltipla)6,10, artrite induzida por colágeno (um modelo animal de artrite de reumatoide humana)7, e diabetes não-obesos (um modelo animal de diabetes do tipo humano 1)8. Além disso, descobrimos que a imunização com um epítopo de Qa-1 tecido-específica leva a controle específico de inflamação imune-mediada em que o tecido através de aumento de CD8+ Treg células12. Os sucessos acima dos estudos pré-clínicos indicam a necessidade de uma avaliação completa de Qa-1 epítopo imunização para o tratamento de doenças de tecido-específica imune-mediada e potencialmente para o tratamento de outras doenças associadas com deficiências na TAP e ERAAP.
Nesse sentido, há uma demanda por uma tecnologia que pode confiantemente e rapidamente analisar resumos de Qa-1 em uma proteína. A este respeito, foi descrito um número limitado de epitopos de Qa-1 biologicamente importantes. A maioria destes resumos de Qa-1 foram identificada por acaso durante o estudo de CD8+ T célula respostas para bactérias13, células deficientes em torneira3, células deficientes em ERAAP4e células que causam EAE6, 9. Portanto, uma técnica de alta taxa de transferência é desejável para a identificação de epitopos de Qa-1 biologicamente importantes em uma proteína definido. A seguir, descrevemos uma estratégia de biblioteca de peptídeo (OLP) sobrepostas que mapeia funcionais epitopos de Qa-1 em uma proteína usando CD8 Qa-1-resrticted+ célula T linhas específicas para o pool OLP (OLP_pool) de uma proteína.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, descrevemos um protocolo para a análise de resumos de Qa-1 em uma proteína. Em relação ao presente protocolo, várias outras estratégias também foram relatadas anteriormente. Em primeiro lugar, alogênico CD8+ linhas de células T e clones foram utilizados para a identificação do Qdm1. Em segundo lugar, um putativo Qa-1-motivo da análise de Qdm foi usado para a identificação da HSP60p216-224 e um epítopo TCRBV8.19,18…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Penelope Garcia para a assistência técnica e preparação deste manuscrito. Este trabalho foi apoiado por uma pesquisa inovação Grant (RIG) do departamento de medicina da Universidade de Loma Linda (681205-2967) e uma concessão piloto da sociedade nacional de esclerose múltipla (PP1685) de XT.
Materials
| The protein to be analyzed | N/A | N/A | Sequence of the protein can be obtained from NCBI |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | Cat#: D2650 SIGMA | DMSO should be sterile and cell culture tested. |
| Kb-/-Db-/- mice | The Lackson Laboratory | Stock#: 019995 | We used Taconic H2-KbH2-Db doube knockout mice (Cat#: 4215-F and 4215-M) which however are not available anymore. |
| AIM V Serum Free Medium | ThermoFisher Scientific | Cat#: 12055091 | |
| 2-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | Cat#: 21985023 | |
| Sodium pyruvate | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11360070 | |
| Nonessential Amino Acids | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11140076 | |
| Dynabeads CD8 Positive Isolation Kit | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11333D | |
| Bio-Gel P-100 | Bio-Rad | Cat#: 150-4171 | |
| Phoshate Balanced Solution (PBS) | ThermoFisher Scientific | Cat#: 20012027 | |
| Trasfer pipette | Globe Scientific | Mfg#: 137238 | |
| Murine M-CSF | PeproTech | Cat#: 315-02 | |
| 48-well tissue culture plates | USA Scientific | Cat#: CC7682-7548 | |
| Corning Costar TC-treated Multiple well Plates, 96-well, V-shaped bottom | Sigma-Aldrich | Cat#: Z372129 Sigma | |
| 1ml deep 06-well PP plate, sterile | USA Scientific | Item#: 1896-1110 | |
| Recombinant murine IL-2 | PeproTech | Cat#: 212-12 | |
| Recombinant murine IL-7 | PeproTech | Cat#L: 217-17 | |
| Capture anti-IFN-γ antibody | BD Biosciences | Cat#: 551881 | |
| ELISPOT plate | Sigma-Aldrich | Cat#: S2EM004M99 | |
| C1R | ATCC | Cat#: ATCC CRL-1993 | |
| C1R.Qa-1b | Custom made (GenBank access#: NM_010398.3) | ||
| Qa-1 lentiviral vector | GeneCopoeia | Product#: Mm02955 | |
| Detection anti-IFN-γ antibody | BD Biosciences | Cat#: 551881 | |
| Tween20 | Sigma-Aldrich | Cat#: P9416 | |
| Streptavidin-HRP | BD Biosciences | Cat#: BD557630 | |
| AEC substrate | BD Biosciences | Cat#: 551951 | |
| ImmunoSpot Analyzer | ImmunoSpot | Any immunoSpot analyer should work for this purpose. |
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