ספריית פפטיד חופפים למפות Epitopes Qa-1 בחלבון
Summary
Qa-1 (הלע-E-אנוש) שייך לקבוצה של מולקולות מורכבות 1b histocompatibility הגדולות-קלאסי. חיסון Qa-1-איגוד epitopes הוכח להגדיל ויסות מערכת החיסון רקמות ספציפיות, דהוא במספר מחלות אוטואימוניות. במסמך זה אנו מתארים את אסטרטגיית ספריית פפטיד חופפים לצורך זיהוי Qa-1 epitopes של חלבון.
Abstract
Qa-1 (הלע-E-אנוש) שייך לקבוצת 1b מורכבים histocompatibility הגדולות-קלאסי מולקולות (MHC-ליברות). נתונים עדכניים מראים כי מולקולות Qa-1 לשחק תפקידים חשובים ב ודיגום תאים עבור ותקינות מבנית תפקודית, ויסות מערכת החיסון וגורם והגבלת תגובות החיסונית זיהומים וירליים. בנוסף, הגדלת פונקציונלי של CD8 Qa-1-מוגבל+ T תאים באמצעות epitope התחסנות הראו השפעות טיפוליות במספר מחלות אוטואימוניות בעלי חיים דגמים, למשל ניסיוני אלרגית דלקת המוח וחוט השדרה, קולגן-induced דלקת מפרקים, סוכרת ולא שמנים. לכן, יש צורך דחוף שיטה ביעילות ובמהירות לזיהוי פונקציונלי epitopes Qa-1 בחלבון. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול אשר מנצל CD8 Qa-1-מוגבל+ תא T שורות ספציפיות עבור ספריה פפטיד (OLP) חופפים לקביעת Qa-1 epitopes של חלבון. ספריית OLP זו מכילה 15-מר פפטידים חופפים המכסות לכל האורך של חלבון, פפטידים סמוכים חופפים על ידי 11 חומצות אמינו. באמצעות פרוטוקול זה, זיהינו לאחרונה epitope Qa-1 9-מר בגליקופרוטאין אוליגודנדרוציטים מיאלין (ש א). זה epitope ש א Qa-1 ממופה לאחרונה הוצגה לזירוז CD8 ספציפית epitope, Qa-1-מוגבלת+ T תאים תקנה המערכת החיסונית משופרת הזה ספציפית מיאלין. לכן, פרוטוקול זה שימושי בעתיד לפתוח בחקירה של הרומן יעדים ופונקציות של CD8 Qa-1-מוגבל+ T תאים.
Introduction
Qa-1 שייך לקבוצה של 1b מורכבים histocompatibility הגדולות-קלאסי (MHC-ליברות) מולקולות בעכברים. Homolog האנושי שלה הוא הלע-אי ראיות קודמות הוכיחה כי מולקולות Qa-1 יש תפקודים ביולוגיים חשובים. ראשית, מולקולות Qa-1 משחק תפקיד חשוב ודיגום תאים עבור ותקינות מבנית תפקודית. בהקשר זה, Qa-1 מולקולות התפתחו מספר אסטרטגיות כדי לנטר את התיפקוד הרגיל של תא. אסטרטגיה אחת כזו מאפשרת מולקולות Qa-1 ל קומפלקסי טופס עם מנהיג מעובד פפטיד (epitope), כלומר ה-Qa-1 הקובע צירוף (אותה לא ישכחו במהרה) המעובדים של מולקולות MHC-Ia קלאסית רשתית תוך-פלזמית1. אלה של Qa-1/אותה לא ישכחו במהרה מתחמי מאוחר יותר להציג על פני השטח של התא, להיקשר לקולטנים NKG2A מעכבות בתאי NK לעכב NK הורג פעילות2. אם הביטוי של מולקולות MHC-Ia אובד, תא (למשל תא ממאיר) הופך רגיש NK להרוגשניים. האסטרטגיה אחרים מאפשר Qa-1 מולקולות להקים מתחמי Qa-1/epitope חדשים על פני התא בנכונותם ברז (טרנספורטר המשויך עיבוד אנטיגן)3 ו/או ERAAP (aminopeptidase רשתית תוך-פלזמית המשויך עיבוד אנטיגן)4 (שני ליקויים לעיתים קרובות להתרחש בתאים ממאירים). התא המבטאת אלה מתחמי Qa-1/epitope חדש יכול להיות מזוהה ואז חוסל על ידי epitope ספציפיים CD8 Qa-1-מוגבל+ T תאים. שנית, Qa-1 מולקולות זירוז מערכת החיסון תקנה5. בהקשר זה, מתחמי Qa-1/epitope הוכחו לעורר CD8+ הרגולציה ותאי T (Treg) חשובים למניעת נזקי בתיווך החיסון העצמי-רקמות6,7,8 ,9,10. שלישית, CD8 Qa-1-מוגבל+ Treg תאים הוכחו להגביל את תגובות מערכת החיסון נגד זיהום ויראלי11.
לכן, הגדלת ספציפי של CD8 Qa-1-restrictred epitope ספציפי+ T תאים היא אסטרטגיה פוטנציאל מבטיח עבור חיסול של תאים חריגים, על השיפור של ויסות מערכת החיסון ועל לפקד על המשמעות של תגובות חיסוניות הנוצרות על-ידי וירוס. בזמן זה טרם נקבע אם תוספת ספציפית epitope CD8 Qa-1-מוגבל+ T תאים באפשרותך לשפר את המערכת החיסונית מעקב ולהגביל הנוצרות על-ידי וירוס תגובות חיסוניות, מעבדות שלנו ואחרים בבירור הוכיחו את זה חיסון epitopes Qa-1 יכול להגדיל את הפונקציה של CD8 Qa-1-מוגבל+ Treg תאים ספציפיים עבור פתוגניים CD4 אוטואימוניות+ T תאים, שמוביל שליטה יעילה של CD4+ T תאית מחלות אוטואימוניות ב מגוון רחב של החיות מודלים כגון6,ניסיוני אלרגית דלקת המוח וחוט השדרה (במודל חיה של טרשת נפוצה אנושי)10, דלקת מפרקים הנגרמת קולגן (במודל חיה של דלקת מפרקים שגרונית אנושי)7, ו סוכרת שאינו שמנים (במודל חיה של האדם סוג 1 סוכרת)8. בנוסף, גילינו כי חיסון epitope Qa-1 רקמות ספציפיות מוביל פקד מסוים של דלקת החיסונית בתיווך תפולס דרך הגדלת של CD8+ Treg תאים12. ההצלחות לעיל של מחקרים פרה להצביע על הערכה מלאה התחסנות epitope Qa-1 לטיפול של רקמות ספציפיות בתיווך החיסונית מחלות ואפשרות עבור הטיפול במחלות אחרות המשויכות ליקויים ברז, ERAAP.
בהתאם לכך, יש ביקוש טכנולוגיה ניתן באמינות ובמהירות לנתח Qa-1 epitopes של חלבון. בהקשר זה, תואר מספר מוגבל של epitopes Qa-1 חשוב מבחינה ביולוגית. רוב epitopes Qa-1 אלה זוהו serendipitously במהלך המחקר של CD8+ T תא התגובות חיידקים13, לקוי ברז3תאים, התאים לקויה ERAAP4ותאים הגורמות EAE6, 9. לכן, טכניקה תפוקה גבוהה רצוי לצורך זיהוי ביולוגית חשובה epitopes Qa-1 בחלבון מוגדר. בחלק זה, אנו מתארים את אסטרטגיית ספריית פפטיד (OLP) חופפים הממפה פונקציונלי epitopes Qa-1 בחלבון באמצעות CD8 Qa-1-resrticted+ תא T שורות ספציפיות עבור הבריכה OLP (OLP_pool) של חלבון.
Protocol
Representative Results
Discussion
. הנה, תארנו פרוטוקול לניתוח Qa-1 epitopes של חלבון. ביחס פרוטוקול זה, מספר אסטרטגיות אחרות גם דווחו בעבר. ראשית, allogeneic CD8+ תא T קווים שיבוטים שימשו לצורך זיהוי ה1-אותה לא ישכחו במהרה. שנית, מוטיב Qa-1-איגוד בשם מניתוח המצב אותה לא ישכחו במהרה שימש לצורך הזיהוי של HSP60p216-224,9</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים פנלופה גרסיה על הכנת כתב היד הזה וסיוע טכני שלה. עבודה זו נתמכה על ידי מחקר וחדשנות גרנט (מעטה) מ במחלקה לרפואה באוניברסיטת לומה לינדה (681205-2967), מענק פיילוט מהחברה טרשת הלאומי (PP1685) XT.
Materials
| The protein to be analyzed | N/A | N/A | Sequence of the protein can be obtained from NCBI |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | Cat#: D2650 SIGMA | DMSO should be sterile and cell culture tested. |
| Kb-/-Db-/- mice | The Lackson Laboratory | Stock#: 019995 | We used Taconic H2-KbH2-Db doube knockout mice (Cat#: 4215-F and 4215-M) which however are not available anymore. |
| AIM V Serum Free Medium | ThermoFisher Scientific | Cat#: 12055091 | |
| 2-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | Cat#: 21985023 | |
| Sodium pyruvate | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11360070 | |
| Nonessential Amino Acids | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11140076 | |
| Dynabeads CD8 Positive Isolation Kit | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11333D | |
| Bio-Gel P-100 | Bio-Rad | Cat#: 150-4171 | |
| Phoshate Balanced Solution (PBS) | ThermoFisher Scientific | Cat#: 20012027 | |
| Trasfer pipette | Globe Scientific | Mfg#: 137238 | |
| Murine M-CSF | PeproTech | Cat#: 315-02 | |
| 48-well tissue culture plates | USA Scientific | Cat#: CC7682-7548 | |
| Corning Costar TC-treated Multiple well Plates, 96-well, V-shaped bottom | Sigma-Aldrich | Cat#: Z372129 Sigma | |
| 1ml deep 06-well PP plate, sterile | USA Scientific | Item#: 1896-1110 | |
| Recombinant murine IL-2 | PeproTech | Cat#: 212-12 | |
| Recombinant murine IL-7 | PeproTech | Cat#L: 217-17 | |
| Capture anti-IFN-γ antibody | BD Biosciences | Cat#: 551881 | |
| ELISPOT plate | Sigma-Aldrich | Cat#: S2EM004M99 | |
| C1R | ATCC | Cat#: ATCC CRL-1993 | |
| C1R.Qa-1b | Custom made (GenBank access#: NM_010398.3) | ||
| Qa-1 lentiviral vector | GeneCopoeia | Product#: Mm02955 | |
| Detection anti-IFN-γ antibody | BD Biosciences | Cat#: 551881 | |
| Tween20 | Sigma-Aldrich | Cat#: P9416 | |
| Streptavidin-HRP | BD Biosciences | Cat#: BD557630 | |
| AEC substrate | BD Biosciences | Cat#: 551951 | |
| ImmunoSpot Analyzer | ImmunoSpot | Any immunoSpot analyer should work for this purpose. |
References
- Aldrich, C. J., et al. Identification of a Tap-dependent leader peptide recognized by alloreactive T cells specific for a class Ib antigen. Cell. 79 (4), 649-658 (1994).
- Vance, R. E., Kraft, J. R., Altman, J. D., Jensen, P. E., Raulet, D. H. Mouse CD94/NKG2A is a natural killer cell receptor for the nonclassical major histocompatibility complex (MHC) class I molecule Qa-1(b). J Exp Med. 188 (10), 1841-1848 (1998).
- Oliveira, C. C., et al. The nonpolymorphic MHC Qa-1 mediates CD8+ T cell surveillance of antigen-processing defects. J Exp Med. 207 (1), 207-221 (2010).
- Nagarajan, N. A., Gonzalez, F., Shastri, N. Nonclassical MHC class Ib-restricted cytotoxic T cells monitor antigen processing in the endoplasmic reticulum. Nat Immunol. 13 (6), 579-586 (2012).
- Hu, D., et al. Analysis of regulatory CD8 T cells in Qa-1-deficient mice. Nat Immunol. 5 (5), 516-523 (2004).
- Tang, X., et al. Regulation of immunity by a novel population of Qa-1-restricted CD8alphaalpha+TCRalphabeta+ T cells. J Immunol. 177 (11), 7645-7655 (2006).
- Leavenworth, J. W., Tang, X., Kim, H. J., Wang, X., Cantor, H. Amelioration of arthritis through mobilization of peptide-specific CD8+ regulatory T cells. J Clin Invest. 123 (3), 1382-1389 (2013).
- Wu, Y., Zheng, Z., Jiang, Y., Chess, L., Jiang, H. The specificity of T cell regulation that enables self-nonself discrimination in the periphery. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (2), 534-539 (2009).
- Panoutsakopoulou, V., et al. Suppression of autoimmune disease after vaccination with autoreactive T cells that express Qa-1 peptide complexes. J Clin Invest. 113 (8), 1218-1224 (2004).
- Tang, X., Maricic, I., Kumar, V. Anti-TCR antibody treatment activates a novel population of nonintestinal CD8 alpha alpha+ TCR alpha beta+ regulatory T cells and prevents experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol. 178 (10), 6043-6050 (2007).
- Holderried, T. A., Lang, P. A., Kim, H. J., Cantor, H. Genetic disruption of CD8+ Treg activity enhances the immune response to viral infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (52), 21089-21094 (2013).
- Wang, X., et al. Targeting Non-classical Myelin Epitopes to Treat Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. Sci Rep. 6, 36064 (2016).
- Lo, W. F., Dunn, C. D., Ong, H., Metcalf, E. S., Soloski, M. J. Bacterial and host factors involved in the major histocompatibility complex class Ib-restricted presentation of Salmonella Hsp 60: novel pathway. Infect Immun. 72 (5), 2843-2849 (2004).
- Xu, W., et al. The nucleocapsid protein of Rift Valley fever virus is a potent human CD8+ T cell antigen and elicits memory responses. PLoS One. 8 (3), e59210 (2013).
- Schumacher, T. N., et al. Peptide selection by MHC class I molecules. Nature. 350 (6320), 703-706 (1991).
- Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. , (2008).
- Guo, H. C., et al. Different length peptides bind to HLA-Aw68 similarly at their ends but bulge out in the middle. Nature. 360 (6402), 364-366 (1992).
- Soloski, M. J., Metcalf, E. S. The involvement of class Ib molecules in the host response to infection with Salmonella and its relevance to autoimmunity. Microbes Infect. 3 (14-15), 1249-1259 (2001).
- Smith, T. R., et al. Dendritic cells use endocytic pathway for cross-priming class Ib MHC-restricted CD8alphaalpha+TCRalphabeta+ T cells with regulatory properties. J Immunol. 182 (11), 6959-6968 (2009).
- Kalra, A., Mukherjee, P., Chauhan, V. S. Characterization of fine specificity of the immune response to a Plasmodium falciparum rhoptry neck protein, PfAARP. Malar J. 15, 457 (2016).
- Kambayashi, T., et al. The nonclassical MHC class I molecule Qa-1 forms unstable peptide complexes. J Immunol. 172 (3), 1661-1669 (2004).
