مكتبة الببتيد المتداخلة لتعيين سؤال وجواب-1 [ابيتوبس] في بروتين
Summary
سؤال وجواب-1 (هلا ه في الإنسان) ينتمي إلى مجموعة من جزيئات معقدة 1b histocompatibility الرئيسية غير الكلاسيكية. لقد ثبت التحصين مع [ابيتوبس] سؤال وجواب 1-ملزم زيادة تنظيم خاص بالانسجة المناعية، والتخفيف من عدة أمراض المناعة الذاتية. هذه الوثيقة يصف لنا استراتيجية مكتبة ببتيد متداخلة لتحديد سؤال وجواب-1 [ابيتوبس] في بروتين.
Abstract
سؤال وجواب-1 (هلا ه في الإنسان) ينتمي إلى مجموعة من هيستوكومباتيبيليتي الرئيسية غير الكلاسيكية المعقدة 1b جزيئات (MHC-Ib). البيانات الأخيرة تشير إلى أن جزيئات سؤال وجواب-1 تلعب أدواراً هامة في مسح الخلايا للسلامة الهيكلية والوظيفية، وحمل النظام المناعي، وتحد من الاستجابات المناعية للعدوى الفيروسية. بالإضافة إلى ذلك، زيادة وظيفية من سؤال وجواب 1-المقيدة-CD8+ تي الخلايا عن طريق حانمه التحصين قد أظهرت الآثار العلاجية في عدة نماذج حيوانية أمراض المناعة الذاتية، مثل النخاع حساسية التجريبية، الكولاجين-الناجم عن التهاب المفاصل، ومرض السكري غير السمنة. ولذلك، هناك حاجة ملحة لأسلوب الذي يمكن، بسرعة وكفاءة تحديد الوظيفية [ابيتوبس] 1 سؤال وجواب في بروتين. هنا، يمكننا وصف بروتوكول يستخدم CD8 سؤال وجواب 1-المقيدة-+ خلية T خطوط محددة لمكتبة ببتيد (OLP) متداخلة لتحديد سؤال وجواب-1 [ابيتوبس] في بروتين. تحتوي هذه المكتبة OLP على 15-مير الببتيدات المتداخلة التي تغطي كامل طول البروتين، وتداخل الببتيدات المتاخمة بالأحماض الأمينية 11. باستخدام هذا البروتوكول، حددنا مؤخرا حانمه سؤال وجواب-1 9-مير في المايلين أوليجوديندروسيتي بروتين سكري (موج). وأبدى هذا حانمه موج سؤال وجواب-1 المعين حديثا لحمل CD8 حانمه على حدة، وسؤال وجواب 1-المقيدة-+ تي الخلايا أن التنظيم المناعي المحسن المايلين على حدة. ولذلك، هذا البروتوكول مفيد للتحقيق في المستقبل من رواية أهداف ومهام CD8 سؤال وجواب 1-المقيدة-+ تي الخلايا.
Introduction
سؤال وجواب-1 ينتمي إلى مجموعة من هيستوكومباتيبيليتي الرئيسية غير الكلاسيكية المعقدة 1b جزيئات (MHC-Ib) في الفئران. في homolog الإنسان هو هلا-هاء وقد أثبتت الأدلة السابقة أن جزيئات سؤال وجواب-1 الوظائف البيولوجية الهامة. أولاً، سؤال وجواب-1 الجزيئات تلعب دوراً مهما في مسح الخلايا للسلامة الهيكلية والوظيفية. وفي هذا الصدد، تطورت جزيئات سؤال وجواب-1 عدة استراتيجيات لرصد وظيفة طبيعية للخلية. واحد هذه الاستراتيجية تمكن جزيئات سؤال وجواب-1 نموذج المجمعات مع زعيم مجهزة ببتيد (حانمه)، أي سؤال وجواب-1 حاسما المعدل (قدم) التي يتم معالجتها من جزيئات MHC-Ia الكلاسيكية في هيولى1. هذه المجمعات سؤال وجواب-1/قدم في وقت لاحق عرض على سطح الخلية وربط لمستقبلات NKG2A المثبطة في ناغورني كاراباخ الخلايا تمنع ناغورني كاراباخ قتل النشاط2. إذا فقدت التعبير عن جزيئات MHC-Ia، يصبح الحساسة إلى ناغورني كاراباخ أسفر عن مقتل2خلية (مثل خلية خبيثة). الاستراتيجية الأخرى التي تمكن جزيئات 1 سؤال وجواب لتشكيل جديد سؤال وجواب-1/حانمه المجمعات على سطح خلية قصور في برنامج المشورة التقنية (متعهد النقل المرتبطة بتجهيز مستضد)3 و/أو آراب (أمينوبيبتيداسي هيولى المرتبطة تجهيز مستضد)4 (كل القصور غالباً ما تحدث في الخلايا الخبيثة). يمكن ثم سلم الخلية التي تعرب عن هذه المجمعات سؤال وجواب-1/حانمه الجديدة والقضاء بسؤال وجواب 1-المقيدة-CD8 حانمه-المحددة+ تي الخلايا. ثانيا، حمل جزيئات سؤال وجواب-1 تنظيم المناعة5. وفي هذا الصدد، أظهرت مجمعات سؤال وجواب-1/حانمه لحفز CD8+ خلايا تي (تريغ) التنظيمية الهامة للوقاية من الأضرار بوساطة جهاز المناعة الذاتي-الأنسجة6،،من78 ،،من910. وثالثاً، سؤال وجواب 1-المقيدة-CD8+ تريغ الخلايا قد ثبت أن تحد من الاستجابات المناعية ضد العدوى الفيروسية11.
ولذلك، زيادة معينة محددة حانمه سؤال وجواب-1-ريستريكتريد CD8+ تي الخلايا استراتيجية واعدة يحتمل أن للقضاء على خلايا غير طبيعية لتعزيز النظام المناعي للتحكم في الحجم الاستجابات المناعية الناجمة عن الفيروس. في حين أنه لم يحدد ما إذا كانت زيادة محددة حانمه CD8 سؤال وجواب 1-المقيدة-+ تي الخلايا يمكن أن تعزز مراقبة محصنة وتحد من الاستجابات المناعية الناجمة عن الفيروس، ولدينا مختبرات وغيرها قد أظهرت بوضوح أن يمكن زيادة التحصين مع [ابيتوبس] سؤال وجواب-1 وظيفة CD8 سؤال وجواب 1-المقيدة-+ تريغ الخلايا المحددة لخلايا CD4 الذاتية المسببة للأمراض+ تي الخلايا، مما أدى إلى السيطرة الفعالة على CD4+ أمراض المناعة الذاتية بوساطة الخلايا تي في نماذج متنوعة من الحيوانات مثل النخاع حساسية التجريبية (نموذج حيوان البشرية التصلب المتعدد)6،10،7من التهاب المفاصل الناجم عن الكولاجين (نموذج حيوان من التهاب المفاصل الرثياني البشرية)، و السكري غير البدناء (نموذج حيوان مرض السكري من النوع البشري 1)8. بالإضافة إلى ذلك، لقد اكتشفنا أن التحصين مع حانمه سؤال وجواب-1 خاصة بأنسجة ويؤدي إلى محددة السيطرة على الالتهاب المناعي بوساطة في هذه الأنسجة من خلال زيادة CD8 الخلايا+ تريغ12. النجاحات المذكورة أعلاه من الدراسات الإكلينيكية تشير إلى حاجة لإجراء تقييم كامل للتحصين حانمه 1 سؤال وجواب لعلاج أمراض المناعة بوساطة الأنسجة على حدة، ويحتمل أن تكون للعلاج من الأمراض الأخرى المرتبطة بأوجه القصور في برنامج المشورة التقنية و آراب.
وبناء على ذلك، هناك طلب لتكنولوجيا التي يمكن موثوق بها وسرعة تحليل [ابيتوبس] 1 سؤال وجواب في بروتين. وفي هذا الصدد، وصف عدد محدود من هامة بيولوجيا 1 سؤال وجواب [ابيتوبس]. تم تحديد معظم هذه [ابيتوبس] سؤال وجواب-1 سيرينديبيتوسلي خلال دراسة CD8+ تي الخلية الردود على البكتيريا13والخلايا ناقصة في الحنفية3، قاصرة عن آراب4خلايا والخلايا التي تسبب ع6، 9. ولذلك يستحسن تقنية إنتاجية عالية للتعرف على [ابيتوبس] سؤال وجواب-1 هامة بيولوجيا في بروتين محددة. في ما يلي، يمكننا وصف استراتيجية متداخلة لمكتبة ببتيد (OLP) الخرائط الوظيفية [ابيتوبس] 1 سؤال وجواب في بروتين باستخدام CD8 سؤال وجواب-1-ريسرتيكتيد+ خلية T خطوط محددة لتجمع OLP (OLP_pool) من البروتين.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، لقد قمنا بوصف بروتوكول لتحليل [ابيتوبس] 1 سؤال وجواب في بروتين. فيما يتعلق بهذا البروتوكول، كما أبلغ عدة استراتيجيات أخرى سابقا. CD8 أولاً، متمكنة+ واستخدمت خطوط الخلايا T واستنساخ للتعرف على قدم1. وثانيا، استخدمت فكرة سؤال وجواب 1-ملزم المفترضة من تحليل قدم للتعرف على …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر “غارسيا بينيلوب” لها المساعدة التقنية وإعداد هذه المخطوطة. أيد هذا العمل منحة الابتكار البحوث (تلاعب) من قسم الطب في جامعة لوما ليندا (681205-2967) ومنحة رائدة من “الجمعية الوطنية للتصلب المتعدد” (PP1685) باختصار.
Materials
| The protein to be analyzed | N/A | N/A | Sequence of the protein can be obtained from NCBI |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | Cat#: D2650 SIGMA | DMSO should be sterile and cell culture tested. |
| Kb-/-Db-/- mice | The Lackson Laboratory | Stock#: 019995 | We used Taconic H2-KbH2-Db doube knockout mice (Cat#: 4215-F and 4215-M) which however are not available anymore. |
| AIM V Serum Free Medium | ThermoFisher Scientific | Cat#: 12055091 | |
| 2-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | Cat#: 21985023 | |
| Sodium pyruvate | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11360070 | |
| Nonessential Amino Acids | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11140076 | |
| Dynabeads CD8 Positive Isolation Kit | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11333D | |
| Bio-Gel P-100 | Bio-Rad | Cat#: 150-4171 | |
| Phoshate Balanced Solution (PBS) | ThermoFisher Scientific | Cat#: 20012027 | |
| Trasfer pipette | Globe Scientific | Mfg#: 137238 | |
| Murine M-CSF | PeproTech | Cat#: 315-02 | |
| 48-well tissue culture plates | USA Scientific | Cat#: CC7682-7548 | |
| Corning Costar TC-treated Multiple well Plates, 96-well, V-shaped bottom | Sigma-Aldrich | Cat#: Z372129 Sigma | |
| 1ml deep 06-well PP plate, sterile | USA Scientific | Item#: 1896-1110 | |
| Recombinant murine IL-2 | PeproTech | Cat#: 212-12 | |
| Recombinant murine IL-7 | PeproTech | Cat#L: 217-17 | |
| Capture anti-IFN-γ antibody | BD Biosciences | Cat#: 551881 | |
| ELISPOT plate | Sigma-Aldrich | Cat#: S2EM004M99 | |
| C1R | ATCC | Cat#: ATCC CRL-1993 | |
| C1R.Qa-1b | Custom made (GenBank access#: NM_010398.3) | ||
| Qa-1 lentiviral vector | GeneCopoeia | Product#: Mm02955 | |
| Detection anti-IFN-γ antibody | BD Biosciences | Cat#: 551881 | |
| Tween20 | Sigma-Aldrich | Cat#: P9416 | |
| Streptavidin-HRP | BD Biosciences | Cat#: BD557630 | |
| AEC substrate | BD Biosciences | Cat#: 551951 | |
| ImmunoSpot Analyzer | ImmunoSpot | Any immunoSpot analyer should work for this purpose. |
References
- Aldrich, C. J., et al. Identification of a Tap-dependent leader peptide recognized by alloreactive T cells specific for a class Ib antigen. Cell. 79 (4), 649-658 (1994).
- Vance, R. E., Kraft, J. R., Altman, J. D., Jensen, P. E., Raulet, D. H. Mouse CD94/NKG2A is a natural killer cell receptor for the nonclassical major histocompatibility complex (MHC) class I molecule Qa-1(b). J Exp Med. 188 (10), 1841-1848 (1998).
- Oliveira, C. C., et al. The nonpolymorphic MHC Qa-1 mediates CD8+ T cell surveillance of antigen-processing defects. J Exp Med. 207 (1), 207-221 (2010).
- Nagarajan, N. A., Gonzalez, F., Shastri, N. Nonclassical MHC class Ib-restricted cytotoxic T cells monitor antigen processing in the endoplasmic reticulum. Nat Immunol. 13 (6), 579-586 (2012).
- Hu, D., et al. Analysis of regulatory CD8 T cells in Qa-1-deficient mice. Nat Immunol. 5 (5), 516-523 (2004).
- Tang, X., et al. Regulation of immunity by a novel population of Qa-1-restricted CD8alphaalpha+TCRalphabeta+ T cells. J Immunol. 177 (11), 7645-7655 (2006).
- Leavenworth, J. W., Tang, X., Kim, H. J., Wang, X., Cantor, H. Amelioration of arthritis through mobilization of peptide-specific CD8+ regulatory T cells. J Clin Invest. 123 (3), 1382-1389 (2013).
- Wu, Y., Zheng, Z., Jiang, Y., Chess, L., Jiang, H. The specificity of T cell regulation that enables self-nonself discrimination in the periphery. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (2), 534-539 (2009).
- Panoutsakopoulou, V., et al. Suppression of autoimmune disease after vaccination with autoreactive T cells that express Qa-1 peptide complexes. J Clin Invest. 113 (8), 1218-1224 (2004).
- Tang, X., Maricic, I., Kumar, V. Anti-TCR antibody treatment activates a novel population of nonintestinal CD8 alpha alpha+ TCR alpha beta+ regulatory T cells and prevents experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol. 178 (10), 6043-6050 (2007).
- Holderried, T. A., Lang, P. A., Kim, H. J., Cantor, H. Genetic disruption of CD8+ Treg activity enhances the immune response to viral infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (52), 21089-21094 (2013).
- Wang, X., et al. Targeting Non-classical Myelin Epitopes to Treat Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. Sci Rep. 6, 36064 (2016).
- Lo, W. F., Dunn, C. D., Ong, H., Metcalf, E. S., Soloski, M. J. Bacterial and host factors involved in the major histocompatibility complex class Ib-restricted presentation of Salmonella Hsp 60: novel pathway. Infect Immun. 72 (5), 2843-2849 (2004).
- Xu, W., et al. The nucleocapsid protein of Rift Valley fever virus is a potent human CD8+ T cell antigen and elicits memory responses. PLoS One. 8 (3), e59210 (2013).
- Schumacher, T. N., et al. Peptide selection by MHC class I molecules. Nature. 350 (6320), 703-706 (1991).
- Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. , (2008).
- Guo, H. C., et al. Different length peptides bind to HLA-Aw68 similarly at their ends but bulge out in the middle. Nature. 360 (6402), 364-366 (1992).
- Soloski, M. J., Metcalf, E. S. The involvement of class Ib molecules in the host response to infection with Salmonella and its relevance to autoimmunity. Microbes Infect. 3 (14-15), 1249-1259 (2001).
- Smith, T. R., et al. Dendritic cells use endocytic pathway for cross-priming class Ib MHC-restricted CD8alphaalpha+TCRalphabeta+ T cells with regulatory properties. J Immunol. 182 (11), 6959-6968 (2009).
- Kalra, A., Mukherjee, P., Chauhan, V. S. Characterization of fine specificity of the immune response to a Plasmodium falciparum rhoptry neck protein, PfAARP. Malar J. 15, 457 (2016).
- Kambayashi, T., et al. The nonclassical MHC class I molecule Qa-1 forms unstable peptide complexes. J Immunol. 172 (3), 1661-1669 (2004).
