In tempo reale tremare-indotta conversione analisi per rilevazione di CWD prioni nel materiale fecale

Malattie da prioni o encefalopatie spongiformi trasmissibili (TSE) sono disordini neurodegenerative compreso la malattia di Creutzfeldt – Jakob (CJD) negli esseri umani, l’encefalopatia spongiforme bovina (BSE) nei bovini, scrapie nelle pecore e capre e di sprecare cronica malattia (CWD) nei cervidi ^1,2. Le TSE sono caratterizzate da aspetto spongiforme distintivo e perdita di neuroni nel cervello. Secondo l’ipotesi della “proteina solo”, i prioni sono costituiti principalmente di PrP^Sc (‘Sc’ scrapie) ³, un’isoforma misfolded della proteina prionica cellulare host-codificati, PrP^C. PrP^Sc risultante dalla conversione di PrP^C in una conformazione arricchita in schede tecniche ᵦ ^4,5,6 , che può agire come un seme di legare e convertire altre molecole di PrP^C . Le molecole di PrP^Sc appena generate sono incorporate in un crescente polimero ^7,8 , che si rompe in oligomeri più piccoli, con conseguente più alti numeri di nuclei infettivi. PrP^Sc è incline all’aggregazione ed è parzialmente resistente alle proteasi ^9,10.

CWD colpisce selvatici e di allevamento degli alci (Cervus canadensis), cervo mulo (Odocoileus hemionus), cervi dalla coda bianca (WTD; Odocoileus virginianus), alce (Alces alces) e la renna (Rangifer tarandus tarandus) ^11,12,13. È considerato la più contagiosa malattia prionica con trasmissione orizzontale favorito da interazioni di cervidi e persistenza ambientale di infettività ^14,15. A differenza di altre malattie da prioni dove PrP^Sc accumulo e infettività sono confinati al cervello, in CWD questi si trovano anche in tessuti periferici e fluidi corporei es. saliva, urina e feci ^{16,17, 18}.

Immunohistochemistry è considerato il gold standard per la diagnosi CWD rilevare la distribuzione di PrP^Sc e lesioni spongiformi ^19,20. ELISA e in casi più rari, macchia occidentale sono utilizzati anche per la diagnostica CWD. Così, la diagnosi delle malattie da prioni attuale si basa principalmente sulla rilevazione di prioni in tessuti post-mortem. La diagnosi ante mortem per CWD è disponibile prendendo le tonsille o le biopsie di tessuto linfoide mucosa-collegato recto-anale (RAMALT); Tuttavia, questa procedura è invasiva e richiede la cattura degli animali. Pertanto, l’uso di esemplari facilmente accessibili, come urina e feci, sarebbe un modo pratico per il rilevamento del prion CWD. Tuttavia, quei harbor escrementi relativamente basse concentrazioni di prioni sotto il limite di rilevamento degli attuali metodi di diagnostici. Di conseguenza, è necessario uno strumento diagnostico più sensibile e più alta di velocità effettiva. Analisi in vitro sistemi di conversione, quali proteina misfolding ciclica amplificazione (PMCA) ²¹, amiloide semina analisi e conversione indotta da tremare in tempo reale (RT-QuIC) dosaggio ^{22,23, 24} sono strumenti molto potenti per sfruttare la capacità auto-moltiplicazione di PrP^Sc di mimare in vitro il processo di conversione da prioni e quindi amplificare la presenza di piccole quantità di PrP^Sc a livelli rilevabili ^{25 ,26}. Tuttavia, il metodo RT-QuIC, sfrutta il fatto che il prodotto di conversione arricchito nella struttura secondaria β-foglio può legano specificamente Tioflavina T (Th-T). Di conseguenza, PrP ricombinante (rPrP) al momento della conversione seminato cresce in fibrille amiloidi che legano Th-T e pertanto possono essere rilevate in tempo reale misurando la fluorescenza della Th-T espresso in unità di fluorescenza relativa (RFU) nel corso del tempo. Una volta controllati, la RFU può essere utilizzata per valutare la relativa attività di semina e parametri quantitativi quali la fase di ritardo. La fase di ritardo rappresenta il tempo (h) necessario per raggiungere la soglia, durante il quale rPrP conversione nella fase iniziale della reazione è inferiore al limite di rilevazione di fluorescenza Th-T. Alla fine della fase di apparente ritardo, concomitante alla formazione di un nucleo dell’amiloide sufficiente (nucleazione/allungamento), si verifica quando la fluorescenza di Th-T supera il livello di soglia e diventa positiva. La crescita di amiloide fibrille possono essere rilevati in tempo reale e l’iniziale PrP^Sc o semina attività contenuta nel campione è amplificata dalla segmentazione che genera più semi. Questi semi inducono a sua volta una rapida fase esponenziale di crescita della fibra dell’amiloide.

Perché questo test è in grado di rilevare basso quanto 1 fg di PrP^{Sc 24}, l’alta sensibilità si qualifica questa tecnica per realizzare ante mortem o diagnosi non invasiva rilevando PrP^Sc in vari tessuti periferici, escrementi o altre tipi di campione che harboring i bassi livelli di infettività. RT-QuIC offre sicuramente vantaggi rispetto altri dosaggi per la sua riproducibilità, praticità, rapidità (meno di 50 h) e bassi costi rispetto alle analisi biologiche. Evita la complessità tecniche quali sonicazione utilizzato in PMCA; Inoltre, viene eseguita in una micropiastra nastro sigillato che minimizza il rischio di contaminazione dell’aerosol di ciascun pozzetto. Il formato multi-pozzetto permette l’analisi di fino a 96 campioni nello stesso esperimento. Per contrastare il problema ricorrente di falsi positivi e conversione spontanea di rPrP nelle analisi in vitro conversione l’implementazione di una soglia (cut-off) in RT-QuIC è molto utile. Infatti, sulla base dei risultati del controllo negativo (media RFU di campioni negativi + 5 SD ²⁷), una linea di base è impostato da cui si può fare discriminazione tra positivi e negativi. L’uso di quattro repliche per ogni campione così può contribuire a definire un campione come positivo quando almeno il 50% dei replicati mostrano un segnale positivo, cioè attraversare il cut-off ²⁸. L’omologia tra seme e substrato non è necessaria in RT-QuIC, come ad esempio in uno studio precedente, criceto rPrP è stato trovato per essere un substrato più sensibile rispetto al substrato omologo in umano PrP^vCJD seminato e scrapie delle pecore seminato reazioni ²⁹. criceto-pecore chimerico rPrP inoltre è stato suggerito un substrato più adatto rispetto umano rPrP per rilevare umano variante CJD prioni ³⁰. Pertanto, l’utilizzo di substrati rPrP da diverse specie è molto comune in questo test. Questo test è stato applicato con successo a parecchie malattie da prioni, quali sporadiche CJD ^31,32,33, gendi malattie da prioni etic ³⁴, BSE ^35,36,37, scrapie ^23,36e CWD ^{38,39,40,41, 42}. Gli studi che utilizzano elaborati del liquido cerebrospinale, sangue intero, saliva e urina come semi in RT-QuIC erano tutti di successo per rilevare PrP^{Sc 38,39,40,41, 42}. per favorire la capacità di rilevazione campioni come nel plasma sanguigno che possono contenere inibitori della formazione dell’amiloide, Orrú et al. (2011) ha sviluppato una strategia per rimuovere potenziali inibitori della formazione dell’amiloide da pettinatura PrP^Sc immunoprecipitazione (IP) passo e RT-QuIC, denominato “enhanced QuIC” dosaggio (eQuIC). Inoltre, un passo di sostituzione del substrato è stato impiegato dopo ~ 24 h tempo di reazione al fine di migliorare la sensibilità. In definitiva, come basso come 1 ag di PrP^Sc era rilevabile da eQuIC ³⁰.

Al fine di purificare le feci estratti e rimuovere gli inibitori possibile dosaggio nelle feci, campioni di feci raccolti nelle fasi precliniche e cliniche da elk al momento dell’infezione orale sperimentale sono stati omogeneizzati in tampone contenente detergenti e inibitori della proteasi. Gli estratti di feci ulteriormente sono stati sottoposti a diverse metodologie per concentrarsi PrP^Sc nei campioni utilizzando la precipitazione della proteina tramite precipitazione di sodio fosfotungstico acido (NaPTA). Il metodo di precipitazione di NaPTA, in primo luogo descritto da Safar et al. ⁴³, è usato per concentrare PrP^Sc in campioni di prova. L’incubazione di NaPTA con i risultati del campione in precipitazione preferenziale di PrP^Sc piuttosto che PrP^C. Tuttavia, il meccanismo molecolare è ancora poco chiaro. Questo passaggio ha aiutato anche contenenti e impedendo la conversione spontanea del rPrP, che si osserva in alcuni casi. Infine, gli estratti di feci sono stati testati da ottimizzato RT-QuIC usando mouse rPrP (aa 23-231) come substrato e compresa la sostituzione del substrato nel protocollo per migliorare la sensibilità di rilevazione.

Qui i risultati dimostrano che questo metodo migliorato in grado di rilevare concentrazioni molto basse di prioni CWD e aumenta la sensibilità di rilevazione e specificità in campioni di feci rispetto a un protocollo senza sostituzione di precipitazione e substrato di NaPTA. Potenzialmente, questo metodo può essere applicato ad altri tessuti e fluidi corporei e può essere di grande utilità per la sorveglianza di CWD nei cervidi selvatici.