Echtzeit-Beben-induzierte Umwandlung Test zur Erkennung von CWD Prionen in Fäkalien

Prion-Krankheiten oder transmissiblen spongiformen Enzephalopathien (TSE) sind Neurodegenerative Erkrankungen einschließlich der Creutzfeldt – Jakob-Krankheit (CJK) beim Menschen, bovine spongiforme Enzephalopathie (BSE) bei Rindern, Scrapie bei Schafen und Ziegen und chronische verschwenden Disease (CWD) in Hirschartigen ^1,2. TSE zeichnen sich durch markante spongiforme aussehen und Verlust von Nervenzellen im Gehirn. Nach der Hypothese “Protein nur” sind Prionen hauptsächlich bestehend aus PrP^Sc (“Sc” für Scrapie) ³, fehlgefaltete Isoform des Host-kodierten zellulären Prion-Proteins, PrP^C. PrP-^Sc ergibt sich aus der Umrechnung von PrP^C eine Konformation in ᵦ-Blätter ^4,5,6 dienen kann, wie ein Samenkorn zu binden und konvertieren andere PrP^C Moleküle angereichert. Die neu generierten PrP^Sc -Moleküle sind in wachsenden Polymer ^7,8 eingearbeitet in kleineren Oligomere, wodurch höhere Anzahl von infektiösen Kerne einbricht. PrP-^Sc ist anfällig für Aggregation und teilweise resistent gegen Proteasen ^9,10.

CWD betrifft, Wild- und Zuchtfisch Elche (Cervus Canadensis), Maultierhirsch (Odocoileus Hemionus), weiß – angebundene Rotwild (WTD; Odocoileus Virginianus), Elch (Alces Alces) und Rentiere (Rangifer Tarandus Tarandus) ^11,12,13. Es gilt die ansteckende Prion-Krankheit mit horizontale Übertragung von Cervid Interaktionen und Umwelt Fortbestehen der Infektiosität ^14,15begünstigt. Im Gegensatz zu anderen Prion-Krankheiten wo PrP^Sc Akkumulation und Infektiosität des Gehirns beschränkt sind, in CWD diese finden auch in peripheren Geweben und Körperflüssigkeiten z.B. Speichel, Urin und Kot ^{16,17, 18}.

Immunohistochemistry gilt als der Goldstandard für CWD Diagnose zur Erkennung von PrP^Sc Verteilung und spongiformen Läsionen ^19,20. ELISA und western-Blot sind in seltenen Fällen auch für CWD Diagnostik verwendet. Somit basiert hauptsächlich aktuelle Prion-Krankheit-Diagnose auf der Erkennung von Prionen in Post-Mortem-Geweben. Ante-Mortem-Diagnose für CWD steht mit Mandeln oder Gewebebiopsien Recto-anal Mukosa-assoziierten lymphatischen (RAMALT); aber dieses Verfahren ist invasiv und erfordert die Erfassung der Tiere. Somit wäre die Verwendung von leicht zugänglichen Exemplare, wie Urin und Kot, eine praktische Möglichkeit für CWD Prion-Erkennung. Aber diese Ausscheidungen Hafen relativ niedrige Konzentrationen von Prionen unterhalb der Nachweisgrenze der aktuellen diagnostischen Methoden. Infolgedessen ist ein empfindlicher und hohen Durchsatz-Diagnose-Tool erforderlich. In-vitro- Conversion-Systeme, wie z. B. Protein misfolding cyclic Amplification assay (PMCA) ²¹, Amyloid Aussaat Assay und Echtzeit-Beben-induzierte Umwandlung (RT-QuIC) Assay ^{22,23, 24} sind sehr mächtige Werkzeuge, der selbst verbreitende Fähigkeit der PrP-^Sc , in Vitro zu imitieren die Prion-Konvertierung zu nutzen und dadurch verstärken die Präsenz der winzige Mengen von PrP^Sc zu nachweisbaren Konzentrationen ^{25 ,26}. Die RT-QuIC-Methode nutzt jedoch die Tatsache, dass die Konvertierung Produkt bereichert in β-Sheet Sekundärstruktur speziell Thioflavin T (TEN-T) binden kann. Daher wächst rekombinante PrP (rPrP) bei der gesäten Wandlung zu Amyloid-Fibrillen, die Th-T zu binden und können somit in Echtzeit durch die Messung der Fluoreszenz von Th-T ausgedrückt als relative Fluoreszenz Einheiten (RFU) im Laufe der Zeit erkannt werden. Sobald überwacht, kann die RFU verwendet werden, um relative seeding Aktivitäten und quantitative Parameter wie der Lag-Phase zu bewerten. Die Lag-Phase stellt die Uhrzeit (h) erforderlich, um die Schwelle zu erreichen, während die rPrP Umsatz in der frühen Phase der Reaktion unter der Nachweisgrenze der Th-T Fluoreszenz ist. Zum Jahresende die scheinbare Verzögerung Phase, zur Bildung von einem ausreichend Amyloid-Kern (Keimbildung/Dehnung), begleitende tritt auf, wenn die Th-T Fluoreszenz den Schwellenwert überschreitet und wird positiv. Das Wachstum von Amyloid Fibrillen in Echtzeit und die anfängliche PrP^Sc oder Sämaschinen Aktivität in der Probe enthaltenen nachgewiesen werden können wird durch Segmentierung verstärkt die mehr Samen erzeugt. Diese Samen verursachen wiederum eine raschere exponentielle Wachstumsphase Amyloid Faser.

Da dieser Test so niedrig wie 1 zu erkennen ist fg PrP^{Sc 24}, die hohe Empfindlichkeit qualifiziert diese Technik, Ante-Mortem oder nichtinvasive Diagnostik zu erreichen durch das Erkennen von PrP^Sc in verschiedenen peripheren Geweben, Ausscheidungen oder andere Arten der Probe geringe Infektiosität beherbergen. RT-QuIC bietet auf jeden Fall Vorteile gegenüber anderen Assays für die Reproduzierbarkeit, Funktionalität, Schnelligkeit (weniger als 50 h) und niedrige Kosten im Vergleich zu Bioassays. Es vermeidet die technische Komplexität wie Beschallung in PMCA verwendet; Darüber hinaus wird es in einem Klebeband versiegelt Mikrotestplatte die Gefahr der Aerosol-Kontamination von jedem Bohrloch minimiert durchgeführt. Die Multi-well-Format ermöglicht die Analyse von bis zu 96 Proben im gleichen Experiment. Um das immer wiederkehrende Problem der Fehlalarme und spontanen Umwandlung von rPrP in der in-vitro- Konvertierung Assays zu begegnen ist die Umsetzung ein Grenzwert (Cut-off) in RT-QuIC sehr nützlich. In der Tat ist basierend auf den Ergebnissen der Negativkontrolle (durchschnittliche RFU von negativen Proben + 5 SD ²⁷), eine Baseline eingerichtet, aus denen Diskriminierung zwischen positiven und negativen Proben erfolgen kann. Die Verwendung von vier Wiederholungen für jede Probe kann somit helfen, definieren eine Probe als positiv, wenn mindestens 50 % der Wiederholungen ein positives Signal zeigen, d.h. cross cut-off- ²⁸. Die Homologie zwischen Samen und Substrat ist in RT-QuIC, nicht erforderlich, wie z. B. in einer früheren Studie, Hamster rPrP gefunden wurde, ein empfindlicher Untergrund im Vergleich zu den homologen Substrat in menschlichen PrP^vCJD entkernt und Schafen Scrapie ausgesät Reaktionen ²⁹. Hamster-Schafe chimärer rPrP wurde auch vorgeschlagen, um ein gut geeigneter Substrat als menschliche rPrP, menschliche Variante CJD Prionen ³⁰zu erkennen sein. Somit ist die Verwendung von rPrP Substraten aus verschiedenen Arten sehr häufig in diesem Test. Dieser Test wurde erfolgreich auf mehrere Prion-Krankheiten, wie z. B. sporadischer CJD ^31,32,33, Gen angewendetSchulrhythmus Prion Krankheiten ³⁴, BSE- ^35,36,37, Scrapie ^23,36und CWD ^{38,39,40,41, 42}. Studien mit verarbeitet, Liquor, Blut, Speichel und Urin als Samen in RT-QuIC alle erfolgreich waren, PrP^{Sc 38,39,40,41,} zu erkennen ⁴²., die Erkennung Fähigkeit in Proben wie Blutplasma zu fördern, die Inhibitoren des Amyloid Bildung enthalten kann Orrú Et Al. (2011) entwickelt eine Strategie, um potentielle Inhibitoren Amyloid Formation entfernen durch Kämmen PrP^Sc Immunopräzipitation (IP) Schritt und RT-QuIC, benannt “enhanced QuIC” Assay (eQuIC). Darüber hinaus wurde ein Substrat Ersatz Schritt nach ~ 24 h Reaktionszeit beschäftigt, um die Empfindlichkeit zu verbessern. Schließlich, als niedrig wie 1 ag von PrP^Sc wurde mit eQuIC ³⁰nachweisbar.

Um Kot Extrakte reinigen und entfernen mögliche Assay-Hemmer im Kot, wurden Kotproben von Elch auf experimentelle orale Infektion in präklinischen und klinischen Stadien gesammelt in Puffer mit Wasch- und Protease-Inhibitoren homogenisiert. Die Kot-Extrakte wurden weitere verschiedene Methoden PrP^Sc in den Proben unter Verwendung Proteinfällung über Natrium Phosphotungstic Acid (NaPTA) Niederschlag konzentrieren vorgelegt. Die NaPTA Niederschlag Methode, erstmals beschrieben von Safar Et al. ⁴³, wird verwendet, um die PrP-^Sc in Proben zu konzentrieren. Die Inkubation von NaPTA mit der Probe führt zu bevorzugten Ausfällung von PrP^Sc anstatt PrP^C. Der molekulare Mechanismus ist jedoch noch unklar. Dieser Schritt hat auch geholfen, Eindämmung und Verhinderung der spontanen Umwandlung von rPrP, die in einigen Fällen beobachtet wird. Zu guter Letzt wurden die Kot-Extrakte von optimierten RT-QuIC mit Maus rPrP (aa 23-231) als Substrat und unter anderem Substrat Ablösung im Protokoll zur Verbesserung der Nachweisempfindlichkeit getestet.

Die Ergebnisse zeigen, dass diese verbesserte Methode sehr geringe Konzentrationen von CWD Prionen erkennt und die Empfindlichkeit der Erkennung und Spezifität in Stuhlproben im Vergleich zu einem Protokoll NaPTA Niederschlag und Substrat ersatzlos erhöht. Diese Methode kann möglicherweise kann zu anderen Geweben und Körperflüssigkeiten angewendet werden und von großem Nutzen für die CWD Überwachung im wilden und Gefangenschaft Hirschartigen.