Вскрытие и подготовка корональных срез развития гипофиза мыши
Summary
Мы представляем протокол вскрыть гипофиза и подготовить гипофиза коронковой части из развивающихся мышей.
Abstract
Гипофиза или гипофиза является важным органом эндокринной секреции гормонов, необходимых для гомеостаза. Он состоит из двух желез с отдельным эмбриональное происхождение и функций — neurohypophysis и adenohypophysis. Развивающихся гипофиза мыши маленькие и тонкие с удлиненной овальной формы. Корональных разделе предпочтителен для отображения в adenohypophysis и neurohypophysis в один срез гипофиза мыши.
Целью настоящего Протокола является достижение надлежащего гипофиза корональных секции с архитектурами хорошо сохранившиеся ткани из развивающихся мышей. В этом протоколе мы подробно описывают, как анализировать и обрабатывать гипофиза правильно из развивающихся мышей. Во-первых мыши фиксируются transcardial перфузии формальдегида до вскрытия. Затем три различных рассечения методы применяются для получения нетронутыми гипофиза в зависимости от возраста мышей. Для плода мышей возрасте от новорожденных и эмбриональных дней (E) 17.5-18,5 до 4 дней, разделяются всей Селла регионов, включая клиновидной кости, железы и тройничного нервов. Для щенков возрасте послеродовой (P) 5-14 дней, гипофиза связано с тройничного нервов разделяются в целом. Для мышей более 3 недель гипофиза тщательно расчлененный бесплатно от окружающих тканей. Мы также отображать как внедрять гипофиза в надлежащей ориентации с помощью окружающих тканей как ориентиры для получения удовлетворяющих корональных секций. Эти методы полезны при анализе гистологические и развития функции гипофиза в разработке мышей.
Introduction
Гипофиза или гипофиза является важным органом эндокринной секреции гормонов, необходимых для гомеостаза1,2. Анатомически гипофиз является ” два в одном ” структура, состоящая из neurohypophysis и adenohypophysis. Эти компоненты имеют разные эмбриональное происхождение и функции очень по-разному. Neurohypophysis является производным от нейронных эктодермы и выделяет окситоцина и антидиуретического гормона. Adenohypophysis происходит от Ратке в мешочек и несет ответственность за освобождение гормонов, в том числе гормон роста, пролактина, тиреотропный гормон, фолликулостимулирующего гормона, лютеинизирующего гормона, Адренокортикотропный гормон, и 3,– меланоцитов, стимулирующий гормон4,5.
Гипофиз опирается на дорсальной поверхности клиновидной кости (турецкого седла) мыши черепа и прикреплена к полу мозга хрупкий стебель. Он окружен боково тройничного нервов и кпереди от зрительных нервов6,7. Железы обладает удлиненной овальной формы с его длинной оси, перпендикулярной, головы. На спинной поверхности neurohypophysis и adenohypophysis можно легко быть разграничены, с бывших оккупирующих спинной медиальной региона и последнего расширения боков и вентрально. Во время послеродового развития размер гипофиза увеличивается быстро, в первый месяц после рождения8,9. Тем не менее гипофиза мыши все еще очень маленький в размер, средний вес 1,9 мг и Лонг ось диаметром ~ 3 мм в взрослых10, длинные оси диаметром 2-2,5 мм на послеродовой день 21 (P21) и только 1-1,5 мм на P0.
Корональных разделе предпочтителен для отображения adenohypophysis и neurohypophysis в один срез гипофиза мыши. Однако некоторые технические навыки требуются для получения удовлетворяющих коронковой части гипофиза из развивающихся мышей из-за его исключительно небольшой размер и собственный анатомии. В этом видео статьи мы демонстрируем как вскрыть гипофиза мыши и подготовить гипофиза корональных секции на различных этапах.
Protocol
Representative Results
Discussion
Для разработки мышиных pituitaries, он был технически трудно получить правильное корональных секции из-за их маленькие и хрупкие особенности и уникальные анатомические характеристики6,8. Таким образом, некоторые исследовательские группы выбрал середине саги…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана субсидии от национального естественных наук фонд Китая (31201086, 31470759 и 31671219) и Шанхай фонда естественных наук (12ZR1436900).
Materials
| Tools/Equipment | |||
| Surgical scissors-straight | JinZhong | J21010 | can be purchased from other vendors |
| Fine scissors-strainght | JinZhong | WA1010 | can be purchased from other vendors |
| Blunt forceps | JinZhong | JD1020 | can be purchased from other vendors |
| Fine forceps | Dumont | RS-5015 | for isolation of the pituitary |
| 26G (0.45mm) needle | HongDa | for transcardial perfusion | |
| Syringe (1 mL) | BD | 300841 | can be purchased from other vendors |
| Syringe (10 mL) | BD | can be purchased from other vendors | |
| 35mm dish | Corning | 430165 | can be purchased from other vendors |
| Lens cleaning paper | ShuangQuan | can be purchased from other vendors | |
| Anatomical microscope | OLYMPUS | SZX-ILLB2-200 | can be purchased from other vendors |
| Embedding cassette | Thermo Fisher | 22-272423 | can be purchased from other vendors |
| Tissue embedding console system | KEDEE | KD-BM11 | can be purchased from other vendors |
| Microtome | Thermo Fisher | HM315R | can be purchased from other vendors |
| Superfrost-Plus slides | Thermo Fisher | 22-037-246 | can be purchased from other vendors |
| Cover glass | Thermo Fisher | 12-543 | can be purchased from other vendors |
| Fluorescence microscope | OLYMPUS | BH2-RFCA | can be purchased from other vendors |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Urethane | BBI | EB0448 | |
| NaCl | Sigma | S9625 | for PBS |
| KCl | Sigma | P9541 | for PBS |
| Na2HPO4.12H2O | Sigma | 71650 | for PBS |
| K2HPO4 | Sigma | P2222 | for PBS |
| NaNO2 | Sigma | 237213 | |
| Heparin Sodium Injection | SPH | H31022051 | for perfusion saline |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Ethanol | SCR | 10009218 | |
| Xylene | SCR | 10023418 | |
| Paraffin | Thermo Fisher | 8330 | |
| Hematoxylin | Sigma | H9627 | for H&E staining |
| Eosin Y | Sigma | E4009 | for H&E staining |
| rabbit anti growth hormone (GH) | National Hormone | for immunostaining | |
| antibody | Pituitary Program | ||
| Rabbit anti-mouse GFAP antibody | Sigma | G9269 | for immunostaining |
| Goat anti-rabbit IgG, HRP | Jackson | 111-035-003 | for immunostaining |
| TSA system | NEN Life Science Products | NEL700 | for immunostaining |
| Streptavidin, Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher | S32356 | for immunostaining |
| Anti-FITC Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A11090 | for immunostaining |
References
- Fauquier, T., Lacampagne, A., Travo, P., Bauer, K., Mollard, P. Hidden face of the anterior pituitary. Trends Endocrinol Metab. 13 (7), 304-309 (2002).
- Haedo, M. R., et al. Regulation of pituitary function by cytokines. Horm Res. 72 (5), 266-274 (2009).
- Zhu, X., Gleiberman, A. S., Rosenfeld, M. G. Molecular physiology of pituitary development: signaling and transcriptional networks. Physiol Rev. 87 (3), 933-963 (2007).
- Bancalari, R. E., Gregory, L. C., McCabe, M. J., Dattani, M. T. Pituitary gland development: an update. Endocr Dev. 23, 1-15 (2012).
- Kelberman, D., Rizzoti, K., Lovell-Badge, R., Robinson, I. C., Dattani, M. T. Genetic regulation of pituitary gland development in human and mouse. Endocr Rev. 30 (7), 790-829 (2009).
- Peker, S., Kurtkaya-Yapicier, O., Kilic, T., Pamir, M. N. Microsurgical anatomy of the lateral walls of the pituitary fossa. Acta Neurochir (Wien). 147 (6), 641-648 (2005).
- Wolpert, S. M., Molitch, M. E., Goldman, J. A., Wood, J. B. Size, shape, and appearance of the normal female pituitary gland. AJR Am J Roentgenol. 143 (2), 377-381 (1984).
- Carbajo-Perez, E., Watanabe, Y. G. Cellular proliferation in the anterior pituitary of the rat during the postnatal period. Cell Tissue Res. 261 (2), 333-338 (1990).
- Nantie, L. B., Himes, A. D., Getz, D. R., Raetzman, L. T. Notch signaling in postnatal pituitary expansion: proliferation, progenitors, and cell specification. Mol Endocrinol. 28 (5), 731-744 (2014).
- Tzou, S. C., Landek-Salgado, M. A., Kimura, H., Caturegli, P. Preparation of mouse pituitary immunogen for the induction of experimental autoimmune hypophysitis. J Vis Exp. (46), (2010).
- Budry, L., et al. Related pituitary cell lineages develop into interdigitated 3D cell networks. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (30), 12515-12520 (2011).
- Wilson, D. B., Wyatt, D. P. Histopathology of the pituitary gland in neonatal little (lit) mutant mice. Histol Histopathol. 7 (3), 451-455 (1992).
- Jonkers, B. W., Sterk, J. C., Wouterlood, F. G. Transcardial perfusion fixation of the CNS by means of a compressed-air-driven device. J Neurosci Methods. 12 (2), 141-149 (1984).
- Cao, D., et al. ZBTB20 is required for anterior pituitary development and lactotrope specification. Nat Commun. 7, 11121 (2016).
