ניתוח והכנת פרוסה הילתית בפיתוח העכבר בלוטת יותרת המוח
Summary
אנו מציגים פרוטוקול כדי לנתח יותרת ולהכין יותרת המוח מקטעים הילתית מלפתח עכברים.
Abstract
בלוטת יותרת המוח או hypophysis הוא איבר האנדוקרינית חשוב הפרשת הורמונים חיוניים עבור הומאוסטזיס. הוא מורכב שתי בלוטות עם המקורות עובריים נפרד פונקציות – את neurohypophysis ולא את adenohypophysis. בלוטת יותרת המוח המתפתח של העכבר הוא קטן ועדין עם צורה של אליפסה מוארכת. מקטע הילתית הוא העדיף כדי להציג הן adenohypophysis והן neurohypophysis פרוסה אחת של ההיפופיזה העכבר.
המטרה של פרוטוקול זה היא להשיג מקטעים הילתית יותרת המוח תקין עם רקמת שהשתמרו ארכיטקטורות מלפתח עכברים. ב פרוטוקול זה, נתאר בפירוט כיצד לנתח ולעבד יותרת כראוי מלפתח עכברים. ראשית, עכברים נפתרות על-ידי transcardial זלוף פורמלין לפני ניתוח. אז שלוש טכניקות שונות ויבתר מוחלים כדי להשיג שלמות בלוטות יותרת המוח תלוי בגילו של עכברים. עבור עוברי עכברים מגיל 17.5 ימים עובריים (E)-18.5 ו- neonates עד 4 ימים, האזורים סלה כולו לרבות עצם היתד, בלוטה, המשולש העצבים הם גזור. עבור גורים בגילאי כמחנכת ימים (P) 5-14, בלוטות יותרת המוח הקשורים המשולש העצבים הם גזור בכללותה. עבור עכברים מעל בן 3 שבועות, בלוטות יותרת המוח הם בקפידה גזור ללא תשלום מן הרקמות הסובבות. אנחנו גם להציג כיצד להטביע את בלוטות יותרת המוח בכיוון הנכון באמצעות הרקמות הסובבות כמו ציוני דרך כדי להשיג סיפוק מקטעים הילתית. שיטות אלה שימושיים בניתוח תכונות ההתפתחותי היסטולוגית של בלוטות יותרת המוח בפיתוח עכברים.
Introduction
בלוטת יותרת המוח או hypophysis הוא איבר האנדוקרינית חשוב הפרשת הורמונים חיוניים עבור הומאוסטזיס1,2. מבחינה אנטומית, בלוטת יותרת המוח היא מבנה ‘ שני-in-one”הכוללת את neurohypophysis, את adenohypophysis. חלקים אלה יש מקורות עובריים שונים, פונקציה אחרת. Neurohypophysis נגזרת של האאקטודרם עצבית, מפריש אוקסיטוצין, הורמון antidiuretic. Adenohypophysis מקורו נרתיק של ראת’קי, אחראי על השחרור של הורמונים לרבות הורמון גדילה, פרולקטין, תירוטרופין, הורמון מגרה זקיק, הורמון מחלמן, הורמון אדרנוקורטיקוטרופי, ו מלנוציט – הורמון מגרה3,4,5.
בלוטת יותרת המוח נשענת על המשטח הגבי של עצם היתד (אשר) של הגולגולת העכבר ו מחוברת לרצפה של המוח על ידי גבעול שביר. המלון מוקף רוחבית על ידי המשולש העצבים ועל anteriorly ידי הצנטר6,7. בלוטת יש צורה של אליפסה מוארכת עם ציר זמן בניצב לראש. על השטח הגבי שלה, את neurohypophysis, את adenohypophysis יכול בקלות להיות התחום, עם לשעבר הכובש המדיאלי האזור הגבי ולהרחיב את האחרון רוחבית ולא ventrally. במהלך פיתוח כמחנכת, בגודל של יותרת המוח גדל במהירות בחודש הראשון לאחר הלידה8,9. בכל זאת, ההיפופיזה העכבר הוא עדיין קטן מאוד בגודלם במשקל ממוצע של 1.9 מ”ג, קוטר ציר זמן של ~ 3 מ מ למבוגרים10, קוטר ציר זמן של 2-2.5 מ”מ ביום כמחנכת 21 (P21), ולא רק 1-1.5 מ”מ P0.
מקטע הילתית הוא העדיף כדי להציג הן adenohypophysis והן neurohypophysis פרוסה אחת של ההיפופיזה העכבר. עם זאת, כישורים טכניים נדרשים להשיג סיפוק הילתית חלקים ובלוטות יותרת המוח פיתוח עכברים בשל גודל קטן במיוחד שלה האנטומיה ברורה. במאמר זה וידאו, נדגים כיצד לנתח העכבר יותרת ולהכין מקטעים הילתית יותרת המוח בשלבי התפתחות שונים.
Protocol
Representative Results
Discussion
לפיתוח מאתר pituitaries, עברו טכנית קשה להשיג מקטעים הילתית נכונה עקב שלהם תכונות זעירים, שברירית, מאפיינים אנטומיים ייחודיים6,8. כמה קבוצות מחקר ולכן בחרה מקטעים מאמצע-הווריד כדי לנתח את המורפולוגיה של עובריים ו neonatal יותרת המוח11,12…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המענקים של הלאומי מדעי הטבע קרן של סין (31201086, 31470759 ו- 31671219) וקרן מדעי הטבע שנגחאי (12ZR1436900).
Materials
| Tools/Equipment | |||
| Surgical scissors-straight | JinZhong | J21010 | can be purchased from other vendors |
| Fine scissors-strainght | JinZhong | WA1010 | can be purchased from other vendors |
| Blunt forceps | JinZhong | JD1020 | can be purchased from other vendors |
| Fine forceps | Dumont | RS-5015 | for isolation of the pituitary |
| 26G (0.45mm) needle | HongDa | for transcardial perfusion | |
| Syringe (1 mL) | BD | 300841 | can be purchased from other vendors |
| Syringe (10 mL) | BD | can be purchased from other vendors | |
| 35mm dish | Corning | 430165 | can be purchased from other vendors |
| Lens cleaning paper | ShuangQuan | can be purchased from other vendors | |
| Anatomical microscope | OLYMPUS | SZX-ILLB2-200 | can be purchased from other vendors |
| Embedding cassette | Thermo Fisher | 22-272423 | can be purchased from other vendors |
| Tissue embedding console system | KEDEE | KD-BM11 | can be purchased from other vendors |
| Microtome | Thermo Fisher | HM315R | can be purchased from other vendors |
| Superfrost-Plus slides | Thermo Fisher | 22-037-246 | can be purchased from other vendors |
| Cover glass | Thermo Fisher | 12-543 | can be purchased from other vendors |
| Fluorescence microscope | OLYMPUS | BH2-RFCA | can be purchased from other vendors |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Urethane | BBI | EB0448 | |
| NaCl | Sigma | S9625 | for PBS |
| KCl | Sigma | P9541 | for PBS |
| Na2HPO4.12H2O | Sigma | 71650 | for PBS |
| K2HPO4 | Sigma | P2222 | for PBS |
| NaNO2 | Sigma | 237213 | |
| Heparin Sodium Injection | SPH | H31022051 | for perfusion saline |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Ethanol | SCR | 10009218 | |
| Xylene | SCR | 10023418 | |
| Paraffin | Thermo Fisher | 8330 | |
| Hematoxylin | Sigma | H9627 | for H&E staining |
| Eosin Y | Sigma | E4009 | for H&E staining |
| rabbit anti growth hormone (GH) | National Hormone | for immunostaining | |
| antibody | Pituitary Program | ||
| Rabbit anti-mouse GFAP antibody | Sigma | G9269 | for immunostaining |
| Goat anti-rabbit IgG, HRP | Jackson | 111-035-003 | for immunostaining |
| TSA system | NEN Life Science Products | NEL700 | for immunostaining |
| Streptavidin, Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher | S32356 | for immunostaining |
| Anti-FITC Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A11090 | for immunostaining |
References
- Fauquier, T., Lacampagne, A., Travo, P., Bauer, K., Mollard, P. Hidden face of the anterior pituitary. Trends Endocrinol Metab. 13 (7), 304-309 (2002).
- Haedo, M. R., et al. Regulation of pituitary function by cytokines. Horm Res. 72 (5), 266-274 (2009).
- Zhu, X., Gleiberman, A. S., Rosenfeld, M. G. Molecular physiology of pituitary development: signaling and transcriptional networks. Physiol Rev. 87 (3), 933-963 (2007).
- Bancalari, R. E., Gregory, L. C., McCabe, M. J., Dattani, M. T. Pituitary gland development: an update. Endocr Dev. 23, 1-15 (2012).
- Kelberman, D., Rizzoti, K., Lovell-Badge, R., Robinson, I. C., Dattani, M. T. Genetic regulation of pituitary gland development in human and mouse. Endocr Rev. 30 (7), 790-829 (2009).
- Peker, S., Kurtkaya-Yapicier, O., Kilic, T., Pamir, M. N. Microsurgical anatomy of the lateral walls of the pituitary fossa. Acta Neurochir (Wien). 147 (6), 641-648 (2005).
- Wolpert, S. M., Molitch, M. E., Goldman, J. A., Wood, J. B. Size, shape, and appearance of the normal female pituitary gland. AJR Am J Roentgenol. 143 (2), 377-381 (1984).
- Carbajo-Perez, E., Watanabe, Y. G. Cellular proliferation in the anterior pituitary of the rat during the postnatal period. Cell Tissue Res. 261 (2), 333-338 (1990).
- Nantie, L. B., Himes, A. D., Getz, D. R., Raetzman, L. T. Notch signaling in postnatal pituitary expansion: proliferation, progenitors, and cell specification. Mol Endocrinol. 28 (5), 731-744 (2014).
- Tzou, S. C., Landek-Salgado, M. A., Kimura, H., Caturegli, P. Preparation of mouse pituitary immunogen for the induction of experimental autoimmune hypophysitis. J Vis Exp. (46), (2010).
- Budry, L., et al. Related pituitary cell lineages develop into interdigitated 3D cell networks. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (30), 12515-12520 (2011).
- Wilson, D. B., Wyatt, D. P. Histopathology of the pituitary gland in neonatal little (lit) mutant mice. Histol Histopathol. 7 (3), 451-455 (1992).
- Jonkers, B. W., Sterk, J. C., Wouterlood, F. G. Transcardial perfusion fixation of the CNS by means of a compressed-air-driven device. J Neurosci Methods. 12 (2), 141-149 (1984).
- Cao, D., et al. ZBTB20 is required for anterior pituitary development and lactotrope specification. Nat Commun. 7, 11121 (2016).
