Dissektion und koronale Slice Vorbereitung Maus Hypophyse zu entwickeln
Summary
Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll zur Hypophyse zu sezieren und bereiten Hypophyse koronalen Abschnitte von Mäusen zu entwickeln.
Abstract
Die Hirnanhangdrüse oder Hypophyse ist ein wichtiges endokrine Organ Sekretion von Hormonen, die wichtig für die Homöostase. Es besteht aus zwei Drüsen mit getrennten embryonale Herkunft und Funktionen – die Neurohypophysis und die Adenohypophysis. Die entwickelnden Maus pituitäre Drüse ist klein und zart mit eine längliche ovale Form. Ein koronaler Abschnitt wird bevorzugt, um die Adenohypophysis und Neurohypophysis in eine einzige Scheibe der Hypophyse Maus angezeigt.
Das Ziel dieses Protokolls ist es, richtige Hypophyse koronalen Abschnitte mit gut erhaltenen Gewebe Architekturen aus Entwicklungsländern Mäuse zu erreichen. In diesem Protokoll beschrieben detailliert wie man sezieren und Prozess Hypophyse richtig von Mäusen zu entwickeln. Erstens werden Mäuse durch Transcardial Perfusion von Formaldehyd vor der Präparation fixiert. Dann sind drei verschiedene sezierenden Techniken angewendet, um intakte Hypophyse je nach Alter von Mäusen zu erhalten. Für Fetale Mäuse bis 4 Tage embryonalen Tag(e) 17,5-18,5 und Neugeborene bis Jahren, werden die gesamte Sella Regionen einschließlich Sphenoid Knochen, Drüse und Trigeminal Nerven indiziert. Für Welpen sind Alter postnatale Tagen (P) 5-14, der Hypophyse verbunden mit Trigeminal Nerven als Ganzes seziert. Bei Mäusen über 3 Wochen alt sind die Hypophyse sorgfältig frei aus dem umliegenden Gewebe seziert. Gewusst wie: der Hypophyse einbetten in eine korrekte Ausrichtung mithilfe der umgebenden Gewebe als Landmarken zu befriedigen koronalen Abschnitte anzeigen Diese Methoden sind hilfreich bei der Analyse von histologischer und Entwicklungsstörungen Funktionen der Hypophyse bei der Entwicklung von Mäusen.
Introduction
Die Hirnanhangdrüse oder Hypophyse ist ein wichtiges endokrine Organ Sekretion von Hormonen, die wichtig für die Homöostase1,2. Anatomisch ist die Hypophyse eine ” Two-in-One” Struktur bestehend aus der Neurohypophysis und der Adenohypophysis. Diese Teile haben unterschiedliche embryonale Herkunft und Funktion sehr unterschiedlich. Die Neurohypophysis ergibt sich aus der neuralen Ektoderm und sondert Oxytocin und Antidiuretic Hormon. Die Adenohypophysis stammt aus Rathkes-Tasche und ist verantwortlich für die Freisetzung von Hormonen wie Wachstumshormon, Prolaktin, Schilddrüsenhormone – Förderung, Follikel – Förderung Hormon, luteinisierendes Hormon, adrenokortikotropes Hormon, und Melanozyten – Förderung Hormon3,4,5.
Die pituitäre Drüse ruht auf der dorsalen Oberfläche des Sphenoid Knochens (Sella Turcica) des Schädels Maus und wird auf den Boden des Gehirns durch einen fragilen Stiel befestigt. Es ist seitlich umgeben von Trigeminal Nerven und anterior von der Optik Chiasmus6,7. Die Drüse hat eine längliche ovale Form mit seiner Längsachse senkrecht zu der Leiter. Auf der dorsalen Oberfläche können die Neurohypophysis und die Adenohypophysis leicht, mit dem ehemaligen Besatzungsmacht der dorsalen medialen Region und die letzteren, die sich seitlich und ventral abgegrenzt werden. Während der postnatalen Entwicklung steigt die Größe der Hypophyse im ersten Monat nach der Geburt8,9. Dennoch bleibt die Maus Hypophyse sehr klein mit einem durchschnittlichen Gewicht von 1,9 mg und einem langen Achse Durchmesser von ~ 3 mm in Erwachsenen10, einem langen Achse Durchmesser von 2 bis 2,5 mm postnatale Tag 21 (P21) und nur 1-1,5 mm bei P0.
Ein koronaler Abschnitt wird bevorzugt, um Adenohypophysis und Neurohypophysis in eine einzige Scheibe der Hypophyse Maus angezeigt. Allerdings müssen einige technische Fähigkeiten erhalten koronalen Abschnitte der Hypophyse aus Entwicklungsländern Mäuse aufgrund seiner außergewöhnlich geringen Größe und unterschiedliche Anatomie zu befriedigen. In diesem video Artikel zeigen wir, wie zu sezieren Maus Hypophyse Hypophyse koronalen Abschnitte in verschiedenen Entwicklungsphasen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Für die Entwicklung von murinen Hypophysen, wurde es technisch schwierig, geeignete koronalen Abschnitte aufgrund ihrer winzig und zerbrechlich Funktionen und anatomische Besonderheiten6,8zu erhalten. Einige Forschungsgruppen wählte somit Mitte sagittale Abschnitte, die Morphologie der embryonalen und neonatale Hypophyse11,12zu analysieren. Mitte-sagittale Abschnitt der Hypophyse kann aber auch zeigen v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch die Zuschüsse aus dem National Natural Science Foundation of China (31201086, 31470759 und 31671219) und Shanghai Natural Science Foundation (12ZR1436900) unterstützt.
Materials
| Tools/Equipment | |||
| Surgical scissors-straight | JinZhong | J21010 | can be purchased from other vendors |
| Fine scissors-strainght | JinZhong | WA1010 | can be purchased from other vendors |
| Blunt forceps | JinZhong | JD1020 | can be purchased from other vendors |
| Fine forceps | Dumont | RS-5015 | for isolation of the pituitary |
| 26G (0.45mm) needle | HongDa | for transcardial perfusion | |
| Syringe (1 mL) | BD | 300841 | can be purchased from other vendors |
| Syringe (10 mL) | BD | can be purchased from other vendors | |
| 35mm dish | Corning | 430165 | can be purchased from other vendors |
| Lens cleaning paper | ShuangQuan | can be purchased from other vendors | |
| Anatomical microscope | OLYMPUS | SZX-ILLB2-200 | can be purchased from other vendors |
| Embedding cassette | Thermo Fisher | 22-272423 | can be purchased from other vendors |
| Tissue embedding console system | KEDEE | KD-BM11 | can be purchased from other vendors |
| Microtome | Thermo Fisher | HM315R | can be purchased from other vendors |
| Superfrost-Plus slides | Thermo Fisher | 22-037-246 | can be purchased from other vendors |
| Cover glass | Thermo Fisher | 12-543 | can be purchased from other vendors |
| Fluorescence microscope | OLYMPUS | BH2-RFCA | can be purchased from other vendors |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Urethane | BBI | EB0448 | |
| NaCl | Sigma | S9625 | for PBS |
| KCl | Sigma | P9541 | for PBS |
| Na2HPO4.12H2O | Sigma | 71650 | for PBS |
| K2HPO4 | Sigma | P2222 | for PBS |
| NaNO2 | Sigma | 237213 | |
| Heparin Sodium Injection | SPH | H31022051 | for perfusion saline |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Ethanol | SCR | 10009218 | |
| Xylene | SCR | 10023418 | |
| Paraffin | Thermo Fisher | 8330 | |
| Hematoxylin | Sigma | H9627 | for H&E staining |
| Eosin Y | Sigma | E4009 | for H&E staining |
| rabbit anti growth hormone (GH) | National Hormone | for immunostaining | |
| antibody | Pituitary Program | ||
| Rabbit anti-mouse GFAP antibody | Sigma | G9269 | for immunostaining |
| Goat anti-rabbit IgG, HRP | Jackson | 111-035-003 | for immunostaining |
| TSA system | NEN Life Science Products | NEL700 | for immunostaining |
| Streptavidin, Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher | S32356 | for immunostaining |
| Anti-FITC Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A11090 | for immunostaining |
References
- Fauquier, T., Lacampagne, A., Travo, P., Bauer, K., Mollard, P. Hidden face of the anterior pituitary. Trends Endocrinol Metab. 13 (7), 304-309 (2002).
- Haedo, M. R., et al. Regulation of pituitary function by cytokines. Horm Res. 72 (5), 266-274 (2009).
- Zhu, X., Gleiberman, A. S., Rosenfeld, M. G. Molecular physiology of pituitary development: signaling and transcriptional networks. Physiol Rev. 87 (3), 933-963 (2007).
- Bancalari, R. E., Gregory, L. C., McCabe, M. J., Dattani, M. T. Pituitary gland development: an update. Endocr Dev. 23, 1-15 (2012).
- Kelberman, D., Rizzoti, K., Lovell-Badge, R., Robinson, I. C., Dattani, M. T. Genetic regulation of pituitary gland development in human and mouse. Endocr Rev. 30 (7), 790-829 (2009).
- Peker, S., Kurtkaya-Yapicier, O., Kilic, T., Pamir, M. N. Microsurgical anatomy of the lateral walls of the pituitary fossa. Acta Neurochir (Wien). 147 (6), 641-648 (2005).
- Wolpert, S. M., Molitch, M. E., Goldman, J. A., Wood, J. B. Size, shape, and appearance of the normal female pituitary gland. AJR Am J Roentgenol. 143 (2), 377-381 (1984).
- Carbajo-Perez, E., Watanabe, Y. G. Cellular proliferation in the anterior pituitary of the rat during the postnatal period. Cell Tissue Res. 261 (2), 333-338 (1990).
- Nantie, L. B., Himes, A. D., Getz, D. R., Raetzman, L. T. Notch signaling in postnatal pituitary expansion: proliferation, progenitors, and cell specification. Mol Endocrinol. 28 (5), 731-744 (2014).
- Tzou, S. C., Landek-Salgado, M. A., Kimura, H., Caturegli, P. Preparation of mouse pituitary immunogen for the induction of experimental autoimmune hypophysitis. J Vis Exp. (46), (2010).
- Budry, L., et al. Related pituitary cell lineages develop into interdigitated 3D cell networks. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (30), 12515-12520 (2011).
- Wilson, D. B., Wyatt, D. P. Histopathology of the pituitary gland in neonatal little (lit) mutant mice. Histol Histopathol. 7 (3), 451-455 (1992).
- Jonkers, B. W., Sterk, J. C., Wouterlood, F. G. Transcardial perfusion fixation of the CNS by means of a compressed-air-driven device. J Neurosci Methods. 12 (2), 141-149 (1984).
- Cao, D., et al. ZBTB20 is required for anterior pituitary development and lactotrope specification. Nat Commun. 7, 11121 (2016).
