Dissectie en coronale segment voorbereiding van de ontwikkeling van de hypofyse muis
Summary
We presenteren een protocol om te ontleden slijmachtige klieren en bereiden van hypofyse coronale secties van het ontwikkelen van muizen.
Abstract
De hypofyse of hypophysis is een belangrijk endocriene orgaan afscheidende hormonen essentieel voor homeostase. Het bestaat uit twee klieren met aparte embryonale oorsprong en functies — de neurohypophysis en de adenohypophysis. De ontwikkelende muis hypofyse is klein en delicaat met een langgerekte ovale vorm. Bij voorkeur wordt een coronale sectie weer te geven van zowel de adenohypophysis als de neurohypophysis in een enkel sneetje van de hypofyse muis.
Het doel van dit protocol is te bereiken van de juiste hypofyse coronale secties met goed bewaarde weefsel architecturen van het ontwikkelen van muizen. In dit protocol beschrijven we in detail hoe te ontleden en te verwerken van de slijmachtige klieren goed van de ontwikkeling van muizen. Eerst, muizen door transcardial perfusie van formaldehyde vóór dissectie worden opgelost. Vervolgens worden drie verschillende ontleden technieken toegepast om het verkrijgen intact slijmachtige klieren afhankelijk van de leeftijd van muizen. Voor foetale muizen van embryonale dagen (E) 17,5-18,5 en pasgeborenen jaar omhoog tot 4 dagen, worden de regio van de gehele sella’s waaronder het wiggenbeen, klier en trigeminus zenuwen ontleed. Voor pups worden leeftijd postnatale dagen (P) 5-14, de slijmachtige klieren verbonden met trigeminal zenuwen ontleed als een geheel. Voor muizen meer dan 3 weken oud, worden de slijmachtige klieren zorgvuldig ontleed gratis uit de omliggende weefsels. We tonen ook hoe de slijmachtige klieren insluiten in een goede richting met behulp van de omliggende weefsels als monumenten te verkrijgen die voldoen aan de coronale secties. Deze methoden zijn handig bij het analyseren van de histologische en ontwikkelingsproblemen functies van slijmachtige klieren bij de ontwikkeling van muizen.
Introduction
De hypofyse of hypophysis is een belangrijk endocriene orgaan afscheidende hormonen essentieel voor homeostase1,2. De hypofyse is anatomisch, een ” two-in-one” structuur bestaande uit de neurohypophysis en de adenohypophysis. Die onderdelen moeten verschillende embryonale oorsprong en functie zeer verschillend. De neurohypophysis is afgeleid van de neurale ectoderm en scheidt van oxytocine en veel hormoon. De adenohypophysis is afkomstig uit de zak van Rathke en is verantwoordelijk voor het vrijkomen van hormonen waaronder groei-hormoon prolactine, schildklier – stimulerend hormoon, follikelstimulerend hormoon, luteïniserend hormoon, adrenocorticotropic hormoon, en Melanocyt – stimulerend hormoon3,4,5.
De hypofyse berust op het dorsale oppervlak van het wiggenbeen (sella turcica) van de schedel van de muis en aan de verdieping van de hersenen is gekoppeld door een fragiele stengel. Lateraal is omgeven door trigeminal zenuwen en anteriorly de optic opticum6,7. De klier heeft een langwerpige ovale vorm met haar lange as loodrecht staat op die van het hoofd. Op het dorsale oppervlak, kunnen de neurohypophysis en de adenohypophysis gemakkelijk worden afgebakend, met de voormalige bezetten de dorsale mediale regio en de laatste uitbreiding lateraal en ventrally. Tijdens de postnatale ontwikkeling, neemt de grootte van hypofyse toe snel in de eerste maand na de geboorte8,9. De hypofyse muis is echter nog steeds zeer klein in grootte met een gemiddeld gewicht van 1.9 mg en een lange-as diameter van ~ 3 mm in volwassen10, een lange-as diameter van 2-2,5 mm op postnatale dag 21 (P21), en slechts 1-1,5 mm bij P0.
Een coronale sectie heeft de voorkeur om zowel adenohypophysis als neurohypophysis in een enkel sneetje van de hypofyse muis weer te geven. Echter, sommige technische vaardigheden worden vereist om te verkrijgen die voldoen aan de coronale secties van de slijmachtige klieren van het ontwikkelen van muizen vanwege zijn uitzonderlijk kleine formaat en verschillende anatomie. In dit artikel video laten we zien hoe ontleden muis slijmachtige klieren en hypofyse coronale secties voor te bereiden op de verschillende ontwikkelingsstadia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Voor het ontwikkelen van lymfkliertest pituitaries, is het technisch moeilijk te verkrijgen van de juiste coronale secties als gevolg van hun klein en kwetsbaar functies en unieke anatomische kenmerken6,8. Sommige onderzoeksgroepen koos dus mid-Sagittaal secties voor het analyseren van de morfologie van embryonale en neonatale hypofyse11,12. Hoewel de mid-Sagittaal sectie van hypofyse is ook geschikt voor…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de subsidies van nationale Natural Science Foundation van China (31201086, 31470759 en 31671219) en Shanghai Natural Science Foundation (12ZR1436900).
Materials
| Tools/Equipment | |||
| Surgical scissors-straight | JinZhong | J21010 | can be purchased from other vendors |
| Fine scissors-strainght | JinZhong | WA1010 | can be purchased from other vendors |
| Blunt forceps | JinZhong | JD1020 | can be purchased from other vendors |
| Fine forceps | Dumont | RS-5015 | for isolation of the pituitary |
| 26G (0.45mm) needle | HongDa | for transcardial perfusion | |
| Syringe (1 mL) | BD | 300841 | can be purchased from other vendors |
| Syringe (10 mL) | BD | can be purchased from other vendors | |
| 35mm dish | Corning | 430165 | can be purchased from other vendors |
| Lens cleaning paper | ShuangQuan | can be purchased from other vendors | |
| Anatomical microscope | OLYMPUS | SZX-ILLB2-200 | can be purchased from other vendors |
| Embedding cassette | Thermo Fisher | 22-272423 | can be purchased from other vendors |
| Tissue embedding console system | KEDEE | KD-BM11 | can be purchased from other vendors |
| Microtome | Thermo Fisher | HM315R | can be purchased from other vendors |
| Superfrost-Plus slides | Thermo Fisher | 22-037-246 | can be purchased from other vendors |
| Cover glass | Thermo Fisher | 12-543 | can be purchased from other vendors |
| Fluorescence microscope | OLYMPUS | BH2-RFCA | can be purchased from other vendors |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Urethane | BBI | EB0448 | |
| NaCl | Sigma | S9625 | for PBS |
| KCl | Sigma | P9541 | for PBS |
| Na2HPO4.12H2O | Sigma | 71650 | for PBS |
| K2HPO4 | Sigma | P2222 | for PBS |
| NaNO2 | Sigma | 237213 | |
| Heparin Sodium Injection | SPH | H31022051 | for perfusion saline |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Ethanol | SCR | 10009218 | |
| Xylene | SCR | 10023418 | |
| Paraffin | Thermo Fisher | 8330 | |
| Hematoxylin | Sigma | H9627 | for H&E staining |
| Eosin Y | Sigma | E4009 | for H&E staining |
| rabbit anti growth hormone (GH) | National Hormone | for immunostaining | |
| antibody | Pituitary Program | ||
| Rabbit anti-mouse GFAP antibody | Sigma | G9269 | for immunostaining |
| Goat anti-rabbit IgG, HRP | Jackson | 111-035-003 | for immunostaining |
| TSA system | NEN Life Science Products | NEL700 | for immunostaining |
| Streptavidin, Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher | S32356 | for immunostaining |
| Anti-FITC Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A11090 | for immunostaining |
References
- Fauquier, T., Lacampagne, A., Travo, P., Bauer, K., Mollard, P. Hidden face of the anterior pituitary. Trends Endocrinol Metab. 13 (7), 304-309 (2002).
- Haedo, M. R., et al. Regulation of pituitary function by cytokines. Horm Res. 72 (5), 266-274 (2009).
- Zhu, X., Gleiberman, A. S., Rosenfeld, M. G. Molecular physiology of pituitary development: signaling and transcriptional networks. Physiol Rev. 87 (3), 933-963 (2007).
- Bancalari, R. E., Gregory, L. C., McCabe, M. J., Dattani, M. T. Pituitary gland development: an update. Endocr Dev. 23, 1-15 (2012).
- Kelberman, D., Rizzoti, K., Lovell-Badge, R., Robinson, I. C., Dattani, M. T. Genetic regulation of pituitary gland development in human and mouse. Endocr Rev. 30 (7), 790-829 (2009).
- Peker, S., Kurtkaya-Yapicier, O., Kilic, T., Pamir, M. N. Microsurgical anatomy of the lateral walls of the pituitary fossa. Acta Neurochir (Wien). 147 (6), 641-648 (2005).
- Wolpert, S. M., Molitch, M. E., Goldman, J. A., Wood, J. B. Size, shape, and appearance of the normal female pituitary gland. AJR Am J Roentgenol. 143 (2), 377-381 (1984).
- Carbajo-Perez, E., Watanabe, Y. G. Cellular proliferation in the anterior pituitary of the rat during the postnatal period. Cell Tissue Res. 261 (2), 333-338 (1990).
- Nantie, L. B., Himes, A. D., Getz, D. R., Raetzman, L. T. Notch signaling in postnatal pituitary expansion: proliferation, progenitors, and cell specification. Mol Endocrinol. 28 (5), 731-744 (2014).
- Tzou, S. C., Landek-Salgado, M. A., Kimura, H., Caturegli, P. Preparation of mouse pituitary immunogen for the induction of experimental autoimmune hypophysitis. J Vis Exp. (46), (2010).
- Budry, L., et al. Related pituitary cell lineages develop into interdigitated 3D cell networks. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (30), 12515-12520 (2011).
- Wilson, D. B., Wyatt, D. P. Histopathology of the pituitary gland in neonatal little (lit) mutant mice. Histol Histopathol. 7 (3), 451-455 (1992).
- Jonkers, B. W., Sterk, J. C., Wouterlood, F. G. Transcardial perfusion fixation of the CNS by means of a compressed-air-driven device. J Neurosci Methods. 12 (2), 141-149 (1984).
- Cao, D., et al. ZBTB20 is required for anterior pituitary development and lactotrope specification. Nat Commun. 7, 11121 (2016).
