Isolamento em massa e cultivo In Vitro de Intramolluscan fases do sangue fascíola Schistosoma Mansoni
Summary
Este artigo descreve um protocolo para o isolamento de axénica em larga escala e a coleção de miracidia livres de sangue fascíola Schistosoma mansoni e seu posterior processamento para introdução na cultura em vitro .
Abstract
Acasos de sangue humanos, Schistosoma spp., têm um ciclo de vida complexo que envolve as fases do desenvolvimento sexuais e assexuadas dentro de um caracol intermediário e mamífero hospedeiro final, respectivamente. A capacidade de isolar e sustentar os estágios do ciclo de vida diferentes condições em vitro cultura facilitou grandemente as investigações dos mecanismos celulares, bioquímicos e moleculares de regulação, host, desenvolvimento e crescimento do parasita interações. Transmissão da esquistossomose exige reprodução assexuada e o desenvolvimento de múltiplos estágios larvas dentro do anfitrião do caracol; o miracidium infecciosa, através de sporocysts primárias e secundárias, para a fase final do cercarial que é infecciosa para os seres humanos. Neste trabalho apresentamos um protocolo passo a passo para incubação em massa e isolamento de Schistosoma mansoni miracidia de ovos obtidos a partir de fígados de ratos infectados e sua subsequente introdução na cultura em vitro . Prevê-se que o protocolo detalhado irá incentivar novos pesquisadores a participar e ampliar este importante campo de pesquisa esquistossomíase.
Introduction
O ser humano sangue vermes Schistosoma spp., são os agentes causadores da esquistossomose, uma doença tropical negligenciada que afligem um estimado de 230 milhões de pessoas em todo o mundo1. A espécie mais difundida, Schistosoma mansoni, é geograficamente distribuída na América do Sul, o arquipélago das Caraíbas, o Médio Oriente e de África subsahariana2. O ciclo de vida de S. mansonie outros schistosomes, é complexo, envolvendo um mamíferos hospedeiro definitivo e caramujos de água doce do gênero Biomphalaria que servem como hospedeiros intermediários obrigatórios.
Adulto masculino e feminino de S. mansoni verme pares vivem nas veias mesentéricas posteriores de reproduzir o anfitrião dos mamíferos, resultando na liberação de ovos embrionados (óvulos) que se alojaram nas pequenas vênulas da mucosa intestinal. Ovos, em seguida, rompe as paredes dos vasos, migram através do tecido da mucosa e acabaram por inserir o lúmen intestinal onde eles são anulados com as fezes. Quando óvulos digite escotilha de larvas de água doce e livres (miracidia), eles devem, na ordem curta, encontrar um caracol de Biomphalaria apropriado para infectar a fim de continuar seu ciclo de vida. Esse processo de infecção envolve miracidial apego à superfície do corpo exterior o caracol seguido por penetração ativa e entrada da larva no hospedeiro. Logo após a entrada, o miracidium começa a derramar suas placas epidérmicas ciliadas exteriores como forma um sincício que se tornará a nova superfície externa (tegumento) do próximo estágio larval, o sporocyst primário ou mãe. Através de reprodução assexuada, cada sporocyst primário produz e libera uma segunda geração de sporocysts, denominados secundários ou sporocysts filha, que por sua vez, geram e liberar um grande número de fase intramolluscan final, a cercaria3 . Após a fuga do host de caracol, cercárias livres são capazes de anexar a e penetrando diretamente na pele de um humano ou outro hospedeiro adequado mamífera. Com a entrada em seu novo hospedeiro, cercárias transformam-se para a fase de parasitas schistosomula e invadem o sistema vascular. Eles, por sua vez, migraram para o pulmão e depois para a veia hepática onde amadurecem aos vermes adultos, formam pares masculinos e femininos e viajar para as veias mesentéricas para completar seu ciclo de vida.
Intramolluscan de sucesso ou desenvolvimento de “fase de caracol” de schistosomes larvas é essencial para a continuação do ciclo de transmissão humana de host para host. De importância crítica é a seguinte entrada de período do miracidium livres para o host de caracol e a sua transformação precoce à fase primária sporocyst. Dependendo da compatibilidade fisiológica e imunológica entre hospedeiro e parasita, é durante esta fase de desenvolvimento larval esse sucesso inicial ou falha estabelecer infecções é determinado4,5,6 . Desenvolvimento subsequente de primários sporocysts capazes de produzir assexuadamente sporocysts secundários, o que geram humanos-infectantes cercárias, mais exigem um ambiente de host fisiológicas permissiva que fornece para todo o crescimento do parasita e precisa de reprodutiva.
Até à data, pouco é conhecido sobre a base fisiológica, bioquímica e moleculares processos controlar interações esquistossomíase-caracol, especialmente as moléculas e vias envolveram na regulação da reprodução e desenvolvimento larval, ou modulando respostas imunes de anfitrião. Pronto acesso a um grande número destes estágios larval condições em vitro cultura que permitem a manipulação experimental que iria facilitar muito a descoberta de caminhos do desenvolvimento e os mecanismos subjacentes do crescimento celular, diferenciação e reprodução. Caminhos críticos parasita ou mecanismos, identificados através de experimentos em vitro , poderiam então ser usados para interromper o crescimento larval/reprodução do acolhimento de caracol, ou para identificar mecanismos imunes de anfitrião de caracol envolvidos no reconhecimento e eliminação de estágios miracidial ou sporocyst.
Neste artigo e o vídeo de apresentação, nós fornecemos uma descrição detalhada de um método para isolar um grande número de livres de S. mansoni miracidia para introdução em vitro de cultura que pode ser sujeito a acompanhamento experimental manipulação (ver Figura 1 para uma visão esquemática do fluxo de trabalho do protocolo). Embora os procedimentos semelhantes têm sido descritos anteriormente7,8,9, nós sentimos que um protocolo detalhado seria útil para pesquisadores que desejam empregar este modelo para abordar questões ainda sem resposta relacionadas com intramolluscan desenvolvimento larval, proliferação celular e interações imune esquistossomíase-caracol. Além disso, esta abordagem pode facilmente ser adaptada para isolamento de ovos provenientes de outras tremátodes medicamente importantes como bexiga-moradia S. haematobium, solhas de fígado ou acasos de pulmão.
Protocol
Representative Results
Discussion
Miracidia de S. mansoni, isolado e manipulados conforme descrito aqui, pode infectar somente o host intermediário de caracol e, portanto, não representam um risco biológico humano durante esta fase de desenvolvimento larval. No entanto, para evitar a exposição acidental/infecção de caracóis, tenha cuidado para realizar miracidial isolamentos em um local diferente de áreas onde espécies sensíveis de gênero Biomphalaria podem estar presentes ou mantida. Uma sala separada, registrada como espa?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financiado em parte pela concessão de NIH RO1AI015503. Ratos infectados esquistossomíase foram fornecidos pela esquistossomose NIAID Resource Center, no Instituto de pesquisas biomédicas (Rockville, MD) através de HHSN272201000005I de contrato NIAID-NIH para distribuição por meio de recursos do BEI.
Materials
| Chernin's balanced salt solution (CBSS+) | For 1L of solution | ||
| 2.8 g sodium chloride | Fisher Scientific | S271-3 | Dissolve salts, except calcium chloride, and |
| 0.15 g of potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | sugars in 800 mL ddH2O |
| 0.07 g sodium phosphate, dibasic anhydrous | Fisher Scientific | S374-500 | Dissolve calcium chloride separately in 200 |
| 0.45 g magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | M1880 | mL ddH2O |
| 0.53 g calcium chloride dihydrate | Mallinckrodt | 4160 | Slowly add calcium soln to the salt/sugar soln with |
| 0.05 g sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233-3 | with constant mixing |
| 1 g glucose | MP Biomedicals | 152527 | Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a |
| 1 g trehalose | Sigma-Aldrich | T0167 | 0.22 µm disposable bottle-top filter |
| 10 mL 100X penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | Add filtered penicillin and streptomycin soln prior use |
| Incomplete Bge medium (Ibge) | For 900 mL solution | ||
| 220 mL Schneider’s Drosophila medium modified | Lonza | 04-351Q | Mix Schneider's medium with 680 mL ddH2O |
| 4.5 g lactalbumin enzymatic hydrolysate | Sigma-Aldrich | L9010 | Add lactalbumin hydrolysate and galactose |
| 1.3 g galactose | Sigma-Aldrich | G0625 | Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a 0.22 µm pre-sterilized disposable bottle-top filter |
| Complete Bge medium (cBge) | For 100 mL of solution | ||
| 90 mL Incomplete Bge medium | To heat-inactivate FBS: Incubate thawed FBS in | ||
| 9 mL heat-inact. fetal bovine serum (FBS) (Optima) | Atlanta Biologicals | S12450 | waterbath at 60°C for 1 hr while gently |
| 1 mL 100X penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | swirling the bottle every 10 min Aliquot heat-inactivated FBS into 15-mL tubes and store at -20°C. Mix medium + FBS and filter sterilize using a 0.22 µm pre-sterilized disposable bottle-top filter Add penicillin and streptomycin prior to use |
| Pond water (stock solution) | 1L of stock solution | ||
| 12.5 g calcium carbonate | Fisher Scientific | C64-500 | Mix all salts in 1L of ddH2O |
| 1.25 g magnesium carbonate | Fisher Scientific | M27-500 | Note that the salts will not have completely |
| 1.25 g sodium chloride | Fisher Scientific | S271-3 | dissolved. Shake vigorously to suspend |
| 0.25 g potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | salts prior to making the working soln |
| Pond water (working solution) | 1.5L of solution | ||
| 0.8 mL stock solution pond water (shake prior use) in | Mix stock to ddH2O | ||
| 1500 mL of ddH2O | Sterilize pond water by autoclaving (slow cycle) | ||
| 1.5 mL of 100X penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | Add penicillin and streptomycin prior use |
| Saline solution (1.2% NaCl) | 1.5L of solution | ||
| 18 g sodium chloride in 1500 mL of ddH2O | Fisher Scientific | S271-3 | Autoclave saline solution to sterilize |
| 1.5 mL of 100X penicillin/ streptomycin | Hyclone | SV30010 | Add penicillin and streptomycin prior use |
| Additional equipment and material: | |||
| 7-L mouse euthanizing chamber | Following approved IACUC protocol no. V001551 | ||
| Mice | Taconic Biosciences | Swiss-Webster, female, 6-wk old, murine | |
| CO2 tank and regulator | pathogen-free | ||
| 24-well tissue culture plate | TPP | 92424 | |
| 1-L volumetric flasks | |||
| Light source (150W) | Chiu Tech Corp | Model F0-150 | |
| Centrifuge, refrigerated, swinging bucket | Eppendorf | Model 5810R | |
| Centrifuge bottles (250 mL) | Nalgene | ||
| 15-mL centrifuge tubes, sterile | Corning | 430053 | |
| Sterile disposable transfer pipets | Fisher Scientific | 1371120 | |
| 0.22 µm pre-sterilized disposable bottle-top filter | EMD Millipore | SCGPS05RE | |
| Stainless steel blender | Waring Commercial | Model 51BL31 | |
| Blender cup, 100 mL capacity | Waring Commercial | ||
| Inverted compound microscope | Nikon Instruments | Eclipse TE300 |
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