Masse d’Isolation et de la culture In Vitro des étapes apporte de la douve de sang humain Schistosoma Mansoni
Summary
Cet article décrit un protocole d’isolement axénique à grande échelle et de perception des miracidia nageant librement de la douve de sang humaine Schistosoma mansoni et leur traitement ultérieur pour être introduit dans la culture in vitro .
Abstract
Douves du sang humains, Schistosoma spp., ont un cycle de vie complexe qui implique des phases asexuées et sexuées de perfectionnement au sein d’un escargot intermédiaires et mammifère hôte final, respectivement. La capacité d’isoler et de maintenir les étapes du cycle de vie différent en vertu des conditions de culture in vitro a grandement facilité les enquêtes sur les mécanismes cellulaires, biochimiques et moléculaires régulant hôte, le développement et la croissance de parasite interactions. Transmission de la schistosomiase nécessite la reproduction asexuée et le développement de plusieurs stades larvaires chez l’hôte escargot ; le miracidia infectieux, par le biais de sporocystes primaires et secondaires, à la phase finale de cercaires c’est infectieux pour l’homme. Dans cet article, nous présentons un protocole étape par étape pour l’éclosion massive et l’isolement des miracidia Schistosoma mansoni des oeufs provenant de foie de souris infectées et leur introduction ultérieure dans la culture in vitro . Il est prévu que le protocole détaillé encouragera de nouveaux chercheurs de poursuivre et d’élargir cet important domaine de recherche de schistosomiase.
Introduction
L’humain sang douves Schistosoma spp., sont les agents étiologiques de la schistosomiase, une maladie tropicale négligée qui afflige un estimé de 230 millions de personnes dans le monde1. L’espèce la plus répandue, Schistosoma mansoni, est géographiquement distribué en Amérique du Sud, l’archipel des Caraïbes, le Moyen-Orient et l’Afrique subsaharienne2. Le cycle de vie de S. mansoniet autres schistosomes, est complex, faisant intervenir un hôte définitif chez les mammifères et les escargots d’eau douce du genre Biomphalaria qui servent d’hôtes intermédiaires obligatoires.
S. mansoni mâles et femelles adultes ver couples vivant dans les veines mésentériques postérieures de reproduire le mammifère hôte, ce qui entraîne la libération de œufs embryonnés (ovules) qui se loge dans les petites veinules de la muqueuse intestinale. Œufs puis pauses à travers les parois des vaisseaux, migrent à travers le tissu muqueux et finit par entrer dans la lumière intestinale où ils seront annulées par les fèces. Lorsque les ovules entrez hachures de larves nageuses et d’eau douce (miracidies), ils doivent, dans l’ordre court, trouver un escargot Biomphalaria adapté pour infecter afin de poursuivre son cycle de vie. Ce processus d’infection implique miracidiale pièce jointe à surface de l’escargot extérieure suivie de pénétration active et l’entrée de la larve dans l’hôte. Peu de temps après l’entrée, le miracidia commence à jeter ses plaques épidermiques ciliées externes car elle forme un syncytium qui deviendra la nouvelle surface extérieure (tégument) de la prochaine étape larvaire, le sporocyste primaire ou mère. Par le biais de la reproduction asexuée, chaque sporocyste primaire produit et libère une deuxième génération de sporocystes, appelés secondaires ou des sporocystes de fille, qui à son tour, génèrent et libèrent un grand nombre de la dernière étape apporte, la cercaire3 . À échapper à l’hôte de l’escargot, cercaires libres sont capables d’attacher à et directement pénétrer dans la peau d’un hôte mammifère convenable humaine ou autre. Dès l’entrée dans leur nouvel hôte, les cercaires transforment le stade parasitaire schistosomula et envahissent le système vasculaire. Ils, à leur tour, migrent dans les poumons, puis à la veine hépatique où ils mûrissent de vers adultes, forment des couples masculins et féminins et rendre les veines mésentériques pour compléter leur cycle de vie.
Apporte le succès ou le développement de la « phase d’escargot » de schistosomes larvaires est essentiel à la poursuite du cycle de transmission à l’homme hôte-hôte. D’une importance cruciale est la période entrée suivante de la miracidia nageant librement dans l’hôte de l’escargot et sa transformation au début sur la scène du sporocyste primaire. Selon la compatibilité immunologique et physiologique entre l’hôte et le parasite, c’est au cours de cette phase du développement larvaire que succès initial ou l’échec pour établir les infections est déterminé4,5,6 . Développement ultérieur des sporocystes primaires capables de produire par voie asexuée des sporocystes secondaires, qui ensuite génèrent des cercaires homme infectieuse, nécessitent encore un environnement permissif hôte physiologiques qui offre pour l’ensemble de la croissance du parasite et la reproduction a besoin.
A ce jour, on connaît mal le sous-jacent, physiologiques, biochimiques et moléculaires processus régissant les interactions de schistosomes-escargot, surtout les molécules et les voies impliqués dans réglementant la reproduction et le développement larvaire ou modulant réactions immunitaires de l’hôte. Accès facile à un grand nombre de ces stades larvaires dans in vitro culture des conditions qui permettent la manipulation expérimentale faciliterait grandement la découverte de cheminement et les mécanismes sous-jacents de la croissance cellulaire, différenciation et la reproduction. Voies critiques parasite ou mécanismes, identifiés grâce à l’expérimentation in vitro pourraient alors servir de perturber la croissance ou la reproduction larvaire chez l’hôte de l’escargot, ou pour identifier les escargot hôte immunitaire mécanismes impliqués dans la reconnaissance et l’élimination des miracidiale ou sporocyste étapes.
Dans cet article et la vidéo de présentation, nous fournir une description détaillée d’une méthode pour isoler un grand nombre de nageuses S. mansoni miracidia pour être introduit dans la culture in vitro qui peut-être alors être soumise au suivi expérimental manipulation (voir Figure 1 pour une présentation schématique du flux de protocole). Des procédures similaires ont été décrits précédemment7,8,9, nous avons estimé qu’un protocole détaillé serait utile aux chercheurs qui souhaitent utiliser ce modèle pour répondre à des questions encore sans réponse associées à le développement larvaire apporte, prolifération cellulaire et interactions immunitaires schistosomes-escargot. En outre, cette approche pourrait facilement être adaptée pour l’isolement des oeufs des autres trématodes médicalement importants tels que la vessie vivant S. haematobium, douves du foie ou douves du poumon.
Protocol
Representative Results
Discussion
Miracidia de S. mansoni, isolé et manipulé comme décrit ci-après, peut infecter seulement l’hôte intermédiaire d’escargot et par conséquent ne représentent pas un danger biologique humain au cours de cette phase du développement larvaire. Toutefois, pour éviter l’exposition/infection accidentelle d’escargots, il faut pour exécuter des isolations miracidiale dans un emplacement différent des zones où des espèces d’escargots Biomphalaria sensibles peuvent être présents ou entrete…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financé en partie par la subvention de NIH RO1AI015503. Souris infectées par les schistosomes ont été fournis par le NIAID schistosomiase Resource Center à l’Institut de recherche biomédicale (Rockville, MD) par le biais de NIH-NIAID contrat HHSN272201000005I pour distribution au moyen de ressources de la BEI.
Materials
| Chernin's balanced salt solution (CBSS+) | For 1L of solution | ||
| 2.8 g sodium chloride | Fisher Scientific | S271-3 | Dissolve salts, except calcium chloride, and |
| 0.15 g of potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | sugars in 800 mL ddH2O |
| 0.07 g sodium phosphate, dibasic anhydrous | Fisher Scientific | S374-500 | Dissolve calcium chloride separately in 200 |
| 0.45 g magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | M1880 | mL ddH2O |
| 0.53 g calcium chloride dihydrate | Mallinckrodt | 4160 | Slowly add calcium soln to the salt/sugar soln with |
| 0.05 g sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233-3 | with constant mixing |
| 1 g glucose | MP Biomedicals | 152527 | Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a |
| 1 g trehalose | Sigma-Aldrich | T0167 | 0.22 µm disposable bottle-top filter |
| 10 mL 100X penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | Add filtered penicillin and streptomycin soln prior use |
| Incomplete Bge medium (Ibge) | For 900 mL solution | ||
| 220 mL Schneider’s Drosophila medium modified | Lonza | 04-351Q | Mix Schneider's medium with 680 mL ddH2O |
| 4.5 g lactalbumin enzymatic hydrolysate | Sigma-Aldrich | L9010 | Add lactalbumin hydrolysate and galactose |
| 1.3 g galactose | Sigma-Aldrich | G0625 | Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a 0.22 µm pre-sterilized disposable bottle-top filter |
| Complete Bge medium (cBge) | For 100 mL of solution | ||
| 90 mL Incomplete Bge medium | To heat-inactivate FBS: Incubate thawed FBS in | ||
| 9 mL heat-inact. fetal bovine serum (FBS) (Optima) | Atlanta Biologicals | S12450 | waterbath at 60°C for 1 hr while gently |
| 1 mL 100X penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | swirling the bottle every 10 min Aliquot heat-inactivated FBS into 15-mL tubes and store at -20°C. Mix medium + FBS and filter sterilize using a 0.22 µm pre-sterilized disposable bottle-top filter Add penicillin and streptomycin prior to use |
| Pond water (stock solution) | 1L of stock solution | ||
| 12.5 g calcium carbonate | Fisher Scientific | C64-500 | Mix all salts in 1L of ddH2O |
| 1.25 g magnesium carbonate | Fisher Scientific | M27-500 | Note that the salts will not have completely |
| 1.25 g sodium chloride | Fisher Scientific | S271-3 | dissolved. Shake vigorously to suspend |
| 0.25 g potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | salts prior to making the working soln |
| Pond water (working solution) | 1.5L of solution | ||
| 0.8 mL stock solution pond water (shake prior use) in | Mix stock to ddH2O | ||
| 1500 mL of ddH2O | Sterilize pond water by autoclaving (slow cycle) | ||
| 1.5 mL of 100X penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | Add penicillin and streptomycin prior use |
| Saline solution (1.2% NaCl) | 1.5L of solution | ||
| 18 g sodium chloride in 1500 mL of ddH2O | Fisher Scientific | S271-3 | Autoclave saline solution to sterilize |
| 1.5 mL of 100X penicillin/ streptomycin | Hyclone | SV30010 | Add penicillin and streptomycin prior use |
| Additional equipment and material: | |||
| 7-L mouse euthanizing chamber | Following approved IACUC protocol no. V001551 | ||
| Mice | Taconic Biosciences | Swiss-Webster, female, 6-wk old, murine | |
| CO2 tank and regulator | pathogen-free | ||
| 24-well tissue culture plate | TPP | 92424 | |
| 1-L volumetric flasks | |||
| Light source (150W) | Chiu Tech Corp | Model F0-150 | |
| Centrifuge, refrigerated, swinging bucket | Eppendorf | Model 5810R | |
| Centrifuge bottles (250 mL) | Nalgene | ||
| 15-mL centrifuge tubes, sterile | Corning | 430053 | |
| Sterile disposable transfer pipets | Fisher Scientific | 1371120 | |
| 0.22 µm pre-sterilized disposable bottle-top filter | EMD Millipore | SCGPS05RE | |
| Stainless steel blender | Waring Commercial | Model 51BL31 | |
| Blender cup, 100 mL capacity | Waring Commercial | ||
| Inverted compound microscope | Nikon Instruments | Eclipse TE300 |
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