Massa isolatie en In Vitro kweek van Intramolluscan stadia van de menselijke bloed Fluke Schistosoma Mansoni
Summary
Dit artikel beschrijft een protocol voor de grootschalige een isolatie en verzameling van vrijzwemmende miracidia van de menselijk bloed fluke Schistosoma mansoni en hun verdere verwerking voor in vitro cultuur binnenbrengen.
Abstract
Menselijk bloed staartvinnen, Schistosoma spp., hebben een complexe levenscyclus met ongeslachtelijke en seksuele ontwikkeling fasen binnen een slak intermediaire en zoogdieren definitieve gastheer, respectievelijk. De mogelijkheid om te isoleren en in stand houden van de fasen van de levenscyclus van de verschillende omstandigheden in vitro cultuur heeft sterk vergemakkelijkt onderzoek naar de cellulaire, biochemische en moleculaire mechanismen tot regeling van de parasiet groei, ontwikkeling en gastheer interacties. Transmissie van schistosomiasis vereist ongeslachtelijke voortplanting en ontwikkeling van meerdere larvale stadia binnen de slak host; vanuit de infectieuze miracidium, door middel van primaire en secundaire sporocysts, naar de eindfase van de cercarial is dat besmettelijk voor de mens. In deze paper presenteren we een stapsgewijze protocol voor massale broedeieren en isolatie van Schistosoma mansoni miracidia van eieren die zijn verkregen uit de lever van geïnfecteerde muizen en hun latere invoering in in vitro cultuur. Verwacht wordt dat het gedetailleerde protocol nieuwe onderzoekers deelnemen en verbreden van dit belangrijke terrein van Schistosoma onderzoek zal bevorderen.
Introduction
Het menselijk bloed staartvinnen Schistosoma spp., zijn de causatieve agenten van schistosomiasis, een verwaarloosde tropische ziekten teistert een geschatte 230 miljoen mensen wereldwijd1. De meest voorkomende soort, Schistosoma mansoni, is geografisch verdeeld in Zuid-Amerika, de Caribische archipel, het Midden-Oosten en sub-Saharisch Afrika2. De levenscyclus van S. mansonien andere schistosomes, is complex, waarbij een zoogdieren definitieve host en zoetwater slakken van het geslacht Biology die als obligate intermediaire gastheer dienen.
S. mansoni mannelijke en vrouwelijke volwassen worm paren leven in de achterste mesenterische aders van de zoogdieren host reproduceren, resulterend in de release van bebroede eieren (ova) die worden ingediend in de kleine venules van de intestinale mucosa. Eieren vervolgens breekt door de muren van het vaartuig, migreren door mucosal weefsels, en uiteindelijk Voer de intestinale lumen waar zij met de uitwerpselen zijn ongeldig. Wanneer eicellen zoetwater en vrijzwemmende larven (miracidia) broedsel invoert, moeten in korte orde, vinden ze een geschikte Biology slak te infecteren om voort te zetten van de levenscyclus. Deze infectie-proces omvat miracidial gehechtheid aan de slakkengang buiten lichaamsoppervlak gevolgd door actieve penetratie en vermelding van de larve in de gastheer. Kort na binnenkomst begint het miracidium te werpen haar ciliated epidermale Buitenlamellen zoals het vormt een syncytium die als de nieuwe buitenoppervlak (vlies) van de volgende larvale stadium, de primaire of moeder sporocyst fungeren zal. Door middel van ongeslachtelijke voortplanting, elke primaire sporocyst produceert en een tweede generatie van sporocysts, het zogenaamde secundaire of dochter sporocysts, die op zijn beurt, genereren en vrijgeven van grote aantallen van de laatste fase van de intramolluscan, de cercaria3 releases . Bij ontsnappen uit de slak host zijn vrijzwemmende cercariae geschikt voor het aansluiten en direct het penetreren van de huid van een mens of andere geschikte zoogdieren gastheer. Bij binnenkomst in hun nieuwe host, cercariae transformeren naar de parasitaire schistosomula fase en het vasculaire systeem binnen te dringen. Zij, beurtelings, migreren naar de longen en vervolgens naar de hepatische ader waar ze rijpen tot volwassen wormen, mannelijke en vrouwelijke paren vormen en reizen naar de mesenterische aderen te voltooien hun levenscyclus.
Geslaagd intramolluscan of “slak fase” ontwikkeling van larvale schistosomes is essentieel voor de voortzetting van de cyclus van menselijke host-naar-host-transmissie. Is de periode van de volgende vermelding van de vrijzwemmende miracidium in de slak host en haar vroege transformatie tot het stadium van de primaire sporocyst van cruciaal belang. Afhankelijk van de fysiologische en immunologische compatibiliteit tussen host en parasiet is het in deze fase van larvale ontwikkeling dat eerste succes of falen om infecties is vastbesloten4,5,6 . Verdere ontwikkeling van de primaire sporocysts geschikt voor het produceren aardlingen secundaire sporocysts, die vervolgens mens-infectieuze cercariae genereren, verder vereisen een tolerante fysiologische hostomgeving dat voorziet in alle van de parasiet groei en reproductieve moet.
Tot op heden, is weinig bekend over de onderliggende fysiologische, biochemische en moleculaire processen controleren Schistosoma-slak interacties, met name de moleculen en de trajecten betrokken bij larvale ontwikkeling en voortplanting reguleren of modulerende de immuunrespons van de gastheer. Eenvoudige toegang tot grote aantallen van deze larvale stadia omstandigheden in vitro cultuur waarmee experimentele manipulatie zou aanzienlijk vergemakkelijken de ontdekking van ontwikkelings trajecten en onderliggende mechanismen van celgroei, differentiatie en reproductie. Kritische parasiet trajecten of mechanismen, vastgesteld door middel van in vitro experimenten, kunnen vervolgens worden gebruikt larvale groei/reproductie in de slak host verstoren, of identificeren van slak host immuun mechanismen die betrokken zijn bij de erkenning en de eliminatie van de stadia van miracidial of sporocyst.
In dit artikel en een video presentatie, wij bieden een gedetailleerde beschrijving van een methode voor het isoleren van grote aantallen vrijzwemmende S. mansoni miracidia voor in vitro cultuur die vervolgens kan worden onderworpen aan follow-up experimentele binnenbrengen manipulatie (Zie Figuur 1 voor een schematisch overzicht van de werkstroom protocol). Hoewel soortgelijke procedures zijn beschreven eerder7,8,9, vonden we dat een gedetailleerd protocol nuttig voor onderzoekers die tewerkstellen van dit model aan te pakken nog steeds onbeantwoorde vragen met betrekking zijn zou willen tot intramolluscan larval ontwikkeling, cellulaire proliferatie en Schistosoma-slak immuun-interacties. Bovendien, zou kunnen deze aanpak gemakkelijk worden aangepast voor isolatie van eieren uit andere medisch belangrijke darm zoals blaas-woning S. haematobium, staartvinnen lever of Long staartvinnen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Miracidia van S. mansoni, geïsoleerd en gemanipuleerd zoals hierin beschreven kunnen infecteren alleen de slak tussengelegen host, en dus niet vertegenwoordigen een menselijke biohazard tijdens deze fase van larvale ontwikkeling. Echter, accidentele blootstelling/om infectie te voorkomen van slakken, moet worden gewaakt voor het uitvoeren van miracidial isolatie op een andere locatie van gebieden waar ziektegevoelige Biology slak aanwezig of onderhouden kan worden. Een logeerkamer, geregistreerd als BS…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gedeeltelijk gefinancierd door NIH grant RO1AI015503. Schistosoma-geïnfecteerde muizen werden verstrekt door de NIAID Schistosomiasis Resource Center in het biomedisch onderzoeksinstituut (Rockville, MD) door middel van NIH-NIAID Contract HHSN272201000005I voor distributie via BEI middelen.
Materials
| Chernin's balanced salt solution (CBSS+) | For 1L of solution | ||
| 2.8 g sodium chloride | Fisher Scientific | S271-3 | Dissolve salts, except calcium chloride, and |
| 0.15 g of potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | sugars in 800 mL ddH2O |
| 0.07 g sodium phosphate, dibasic anhydrous | Fisher Scientific | S374-500 | Dissolve calcium chloride separately in 200 |
| 0.45 g magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | M1880 | mL ddH2O |
| 0.53 g calcium chloride dihydrate | Mallinckrodt | 4160 | Slowly add calcium soln to the salt/sugar soln with |
| 0.05 g sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233-3 | with constant mixing |
| 1 g glucose | MP Biomedicals | 152527 | Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a |
| 1 g trehalose | Sigma-Aldrich | T0167 | 0.22 µm disposable bottle-top filter |
| 10 mL 100X penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | Add filtered penicillin and streptomycin soln prior use |
| Incomplete Bge medium (Ibge) | For 900 mL solution | ||
| 220 mL Schneider’s Drosophila medium modified | Lonza | 04-351Q | Mix Schneider's medium with 680 mL ddH2O |
| 4.5 g lactalbumin enzymatic hydrolysate | Sigma-Aldrich | L9010 | Add lactalbumin hydrolysate and galactose |
| 1.3 g galactose | Sigma-Aldrich | G0625 | Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a 0.22 µm pre-sterilized disposable bottle-top filter |
| Complete Bge medium (cBge) | For 100 mL of solution | ||
| 90 mL Incomplete Bge medium | To heat-inactivate FBS: Incubate thawed FBS in | ||
| 9 mL heat-inact. fetal bovine serum (FBS) (Optima) | Atlanta Biologicals | S12450 | waterbath at 60°C for 1 hr while gently |
| 1 mL 100X penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | swirling the bottle every 10 min Aliquot heat-inactivated FBS into 15-mL tubes and store at -20°C. Mix medium + FBS and filter sterilize using a 0.22 µm pre-sterilized disposable bottle-top filter Add penicillin and streptomycin prior to use |
| Pond water (stock solution) | 1L of stock solution | ||
| 12.5 g calcium carbonate | Fisher Scientific | C64-500 | Mix all salts in 1L of ddH2O |
| 1.25 g magnesium carbonate | Fisher Scientific | M27-500 | Note that the salts will not have completely |
| 1.25 g sodium chloride | Fisher Scientific | S271-3 | dissolved. Shake vigorously to suspend |
| 0.25 g potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | salts prior to making the working soln |
| Pond water (working solution) | 1.5L of solution | ||
| 0.8 mL stock solution pond water (shake prior use) in | Mix stock to ddH2O | ||
| 1500 mL of ddH2O | Sterilize pond water by autoclaving (slow cycle) | ||
| 1.5 mL of 100X penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | Add penicillin and streptomycin prior use |
| Saline solution (1.2% NaCl) | 1.5L of solution | ||
| 18 g sodium chloride in 1500 mL of ddH2O | Fisher Scientific | S271-3 | Autoclave saline solution to sterilize |
| 1.5 mL of 100X penicillin/ streptomycin | Hyclone | SV30010 | Add penicillin and streptomycin prior use |
| Additional equipment and material: | |||
| 7-L mouse euthanizing chamber | Following approved IACUC protocol no. V001551 | ||
| Mice | Taconic Biosciences | Swiss-Webster, female, 6-wk old, murine | |
| CO2 tank and regulator | pathogen-free | ||
| 24-well tissue culture plate | TPP | 92424 | |
| 1-L volumetric flasks | |||
| Light source (150W) | Chiu Tech Corp | Model F0-150 | |
| Centrifuge, refrigerated, swinging bucket | Eppendorf | Model 5810R | |
| Centrifuge bottles (250 mL) | Nalgene | ||
| 15-mL centrifuge tubes, sterile | Corning | 430053 | |
| Sterile disposable transfer pipets | Fisher Scientific | 1371120 | |
| 0.22 µm pre-sterilized disposable bottle-top filter | EMD Millipore | SCGPS05RE | |
| Stainless steel blender | Waring Commercial | Model 51BL31 | |
| Blender cup, 100 mL capacity | Waring Commercial | ||
| Inverted compound microscope | Nikon Instruments | Eclipse TE300 |
References
- Colley, D. G., Bustinduy, A. L., Secor, W. E., King, C. H. Human schistosomiasis. Lancet. 383, 2253-2264 (2014).
- WHO. Schistosomiasis: number of people treated worldwide in 2013. Wkly. Epidemiol. Rec. 5 (90), 25-32 (2015).
- Yoshino, T. P., Gourbal, B., Théron, A., Jamieson, B. G. M. Schistosoma sporocysts. Schistosoma: biology, pathology and control. , 118-148 (2017).
- Bayne, C. J. Successful parasitism of vector snail Biomphalaria glabrata by the human blood fluke (trematode) Schistosoma mansoni: a 2009 assessment. Mol. Biochem. Parasitol. 165 (1), 8-18 (2009).
- Yoshino, T. P., Coustau, C., Toledo, R., Fried, B. Immunobiology of Biomphalaria-trematode interactions. Biomphalaria snails and larval trematodes. , 159-189 (2011).
- Coustau, C., et al. Advances in gastropod immunity from the study of the interaction between the snail Biomphalaria glabrata and its parasites: A review of research progress over the last decade. Fish Shellfish Immunol. 46 (1), 5-16 (2015).
- Bayne, C. J., Hahn, U. K., Bender, R. C. Mechanisms of molluscan host resistance and of parasite strategies for survival. Parasitology. 123, S159-S167 (2001).
- McMullen, D. B., Beaver, P. C. Studies on schistosome dermatitis. IX. The life cycles of three dermatitis-producing schistosomes from birds and a discussion of the subfamily Bilharziellinae (Trematoda: Schistosomatidae). Amer. J. Hyg. 42, 128-154 (1945).
- Voge, M., Seidel, J. S. Transformation in vitro of miracidia of Schistosoma mansoni and S. japonicum into young sprocysts. J. Parasitol. 58 (4), 699-704 (1972).
- Eloi-Santos, S., Olsen, N. J., Correa-Oliveira, R., Colley, D. G. Schistosoma mansoni: mortality, pathophysiology, and susceptibility differences in male and female mice. Exp. Parasitol. 75 (2), 168-175 (1992).
- Tucker, M. S., Karunaratne, L. B., Lewis, F. A., Freitas, T. C., Liang, Y. S. Schistosomiasis. Curr Proto Immunol. 103, 19.1:19.1.1-19.1.58 (2013).
- Basch, P. F., DiConza, J. J. The miracidium-sporocyst transition in Schistosoma mansoni: surface changes in vitro with ultrastructural correlation. J. Parasitol. 60 (6), 935-941 (1974).
- Hansen, E. L. Secondary daughter sporocysts of Schistosoma mansoni: their occurrence and cultivation. Ann. N. Y. Acad. Sci. 266, 426-436 (1975).
- Stibbs, H. H., Owczarzak, O., Bayne, C. J., DeWan, P. Schistosome sporocyst-killing amoebae Isolated from Biomphalaria glabrata. J. Invertebr. Pathol. 33, 159-170 (1979).
- DiConza, J. J., Basch, P. F. Axenic cultivation of Schistosoma mansoni daughter sporocysts. J. Parasitol. 60 (5), 757-763 (1974).
- Hansen, E. L., Maramorosch, K. A cell line from embryos of Biomphalaria glabrata (Pulmonata): Establishment and characteristics. Invertebrate tissue culture: Research applications. , 75-97 (1976).
- Yoshino, T. P., Laursen, J. R. Production of Schistosoma mansoni daughter sporocysts from mother sporocysts maintained in synxenic culture with Biomphalaria glabrata embryonic (Bge) cells. J. Parasitol. 81 (5), 714-722 (1995).
- Ivanchenko, M. G., et al. Continuous in vitro propagation and differentiation of cultures of the intramolluscan stages of the human parasite Schistosoma mansoni. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 4965-4970 (1999).
- Yoshino, T. P., Bayne, C. J., Bickham, U. Molluscan cells in culture: primary cell cultures and cell lines. Can. J. Zool. 91, 391-404 (2013).
- Coustau, C., Yoshino, T. P. Flukes without snails: Advances in the in vitro cultivation of intramolluscan stages of trematodes. Exp. Parasitol. 94, 62-66 (2000).
- Milligan, J. N., Jolly, E. R. Cercarial transformation and in vitro cultivation of Schistosoma mansoni schistosomules. J. Vis. Exp. (54), e3191 (2011).
- Basch, P. F. Cultivation of Schistosoma mansoniin vitro. II production of infertile eggs by worm pairs cultured from cercariae. J. Parasitol. 67 (2), 186-190 (1981).
