Tek adımlı protokol modu Floresans mikroskobu tarafından radyasyon kaynaklı klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölümü değerlendirilmesi için
Summary
İyonizan radyasyon (IR) araştırma-indüklenen klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölümü Malign tümörler ve normal dokuların IR etkileri anlamak için önemlidir. Burada, biz büyük modları IR kaynaklı klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölümü morfolojisi 4′, 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) üzerinde dayalı değerlendirmek için bir tek adımlı tahlil tarif-floresan mikroskopi tarafından görüntülenmiştir çekirdeği lekeli.
Abstract
İyonizan radyasyon (IR) araştırma-indüklenen klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölümü IR Malign tümörler ve normal dokuların üzerindeki etkisini anlamak için önemlidir. Burada, aynı anda IR, Yani, Apoptozis, Mitotik felaket ve hücresel yaşlanma tarafından indüklenen klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölümü büyük modları değerlendirmek için hızlı ve uygun maliyetli tek adımlı tahlil açıklayın. Bu yöntemde, bir kapak fişinde yetiştirilen hücrelerin x-ışınları ile ışınlanmış ve 4′ ile 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) lekeli. Floresans mikroskobu kullanılarak, Apoptozis, Mitotik felaket ve hücresel yaşlanma DAPI lekeli çekirdeği karakteristik türleri Morfoloji üzerinde göre tanımlanır. Apoptozis apoptotik organları (Yani, yoğun ve parçalanmış çekirdeği) varlığı ile belirlenir. Mitotik felaket sergi iki veya daha fazla ayrı LOB ve micronuclei çekirdeği varlığı ile belirlenir. Hücresel yaşlanma yaşlanma ilişkili heterochromatic foci (Yani, nükleer DNA 30-50 parlak, yoğun foci içeren) varlığı ile belirlenir. Bu yaklaşım deneyci kolayca çeşitli hücre hatları, tedavi ayarları, ve/veya zaman puan, hücre ölümü mekanizmaları hedef hücreleri ve vade farkı şartları elucidating amacı ile kullanarak klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölüm modları için ekran sağlar.
Introduction
İyonizan radyasyon (IR) çoklu modları klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölümü neden olmaktadır. IR kaynaklı klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölümünü araştırmaya IR toksisite normal dokulara anlamak için hem de kanser radyoterapi tedavisi etkinliğini artırmak için yöntemler geliştirmek için önemlidir. Apoptozis, Mitotik felaket ve hücresel yaşlanma IR1tarafından indüklenen klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölümü büyük modları vardır. Apoptozis hücre ölümü DNA hasar1ile başlatılan düzenlenmiş bir moddur. Mitotik felaket Düzeltilmemiş DNA çift iplikli kırılmalara1ile sonuçlanan anormal mitoz nedeniyle oluşur hücre ölümdür. Hücresel yaşlanma geri dönüşü olmayan hücre büyüme tutuklama2bir devlet olarak tanımlanır; Not hücresel yaşlanma hücre ölümü başına değil, ancak bir modu klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölümü senescent hücre klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar yaşama onuntemsilcilerini içindir.
Çeşitli hücre tabanlı deneyleri apoptosis, Mitotik felaket ve hücresel yaşlanma ayrı ayrı değerlendirmek için geliştirilmiştir. Apoptozis Akış Sitometresi1tarafından terminal deoksinükleotidil transferaz dUTP nick uç (tünel) etiketleme boyama, annexin V boyama, DNA parçalanma deneyleri ve alt-G1 hücre döngüsü aşama belirlenmesi tarafından tespit edilebilir. Mitotik felaket Mitotik işaretler için MPM2, tünel boyama ve elektron mikroskobu1de dahil olmak üzere, boyama ayirt tarafından tespit edilebilir. Hücresel yaşlanma yaşlanma ilişkili β-galaktozidaz (SA-β-Gal) Boyama, büyüme-tutuklama deneyleri ve elektron mikroskobu1tarafından tespit edilebilir. Önemlisi, baskın modu klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölümü hücre satırları ve tedavi ayarları3,4arasında farklı. Bu nedenle, belirli bir deneysel ayarı için klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölümü genel profili aydınlatmak için tüm bu modu ölüm kapsayan birden çok deneyleri birlikte, işgücü ve maliyet yoğun olduğu yürütülmelidir.
Bu makalede, biz aynı anda apoptosis, Mitotik felaket ve IR3,4tarafından indüklenen hücresel yaşlanma değerlendirmek için hızlı ve uygun maliyetli tek adımlı tahlil tanımlamak. Bu yöntemde, bir kapak fişinde yetiştirilen hücrelerin x-ışınları ile ışınlanmış ve 4′ ile 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) lekeli. Floresans mikroskobu kullanılarak, Apoptozis, Mitotik felaket ve hücresel yaşlanma her ilgili karakteristik türleri Morfoloji, DAPI lekeli çekirdeği üzerinde göre tanımlanır. Bu yaklaşım çeşitli hücre hatları, tedavi ayarları ve hücre ölümü mekanizmaları hedef hücreleri ve koşullarının araştırılması amacı ile zaman Puan klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölüm profilleri için tarama dahil olmak üzere uygulamaların yararlı olacaktır faiz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokol içindeki kritik adımlar aşağıdaki gibidir. DAPI lekeli çekirdeği morfolojik bir değerlendirme yapılması çok katmanlı hücreler için zor olduğu için ilk olarak, hücre kültür çanak üzerinde monolayer yetiştirilmeye. Bu amaçla, adım 2.9, dikkatli transferi kültür bulaşık kuluçka önerilir; Kültür fincan sallayarak konsantrasyonu hücre kültür yemeğin ortasına yol açar bir girdap askıya alınan hücre üretir. Buna ek olarak, çok katmanlı hücrelere önde gelen overconfluence-meli var olmak kaçmak. Bu amaçla, adım 2.7, kültür çanak üzerinde seribaşı hücre sayısı zaman ve ışınlama ve fiksasyon arasındaki süreyi iki katına popülasyon temelinde değiştirilebilir. Yaklaşık 80 fiksasyon zaman izdiham önerilir. İkinci olarak, hız fiksasyon ve DAPI boyama (Yani, 4 ve 5) önemlidir. Aşağıdaki adımları için geçen süre açısından arası örnek tutarsızlık heterojenite için morfolojik değerlendirme belirsiz çekirdekleri, DAPI sinyal şiddeti yol açabilir.
2.2. adımda kapak fişleri bir tek kültür tabak sayısı artırılabilir; En fazla dört kapak paket fişi bir 35 mm tabak içinde yerleştirilebilir ve sayısı daha da büyük yemekler kullanarak artırılabilir. Her kültür tabak içinde birden fazla kapak paket fişi yerleştirerek saat ders değerlendirmesi (örneğin, paket fişi bir kültür yemek ilgi teker teker birden fazla zaman noktalarda toplanabilir kapak) belirli bir tedavi için verimli çalışmasını sağlar.
3.2. adımda ışınlama doz araştırmacıların ilgi göre değiştirilebilir. Tutarlı bir doz uygulama için birden çok hücre hatları her modu hücre satırları arasında klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölümü için duyarlılık karşılaştırması sağlar. Öte yandan, ISO-klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hayatta kalma doz kullanımı her hücre satırı için klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölüm profilleri hücre satırları arasında karşılaştırma sağlar. ISO-klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hayatta kalma doz klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hayatta kalma tahlil12tarafından belirlenebilir. D10 değeri, % 10 klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hayatta kalma, sağlar doz ISO-klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hayatta kalma doz için ortak bir bitiş noktası olur.
Adım 3.3, saat ışınlama fiksasyon ile araştırmacıların ilgi göre değiştirilebilir; en yoğun zaman IR kaynaklı apoptosis, Mitotik felaket ve hücresel yaşlanma için hücre kültürünü ve tedavi göre değiştiğinden bu önemlidir. Bu makalede, biz 72 h sonra ışınlama klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölüm profilleri, bizim grup tabanlı üzerinde birden fazla çalışmaları başlangıç tarama için en yararlı olacaktır zaman noktası olarak kullanılan ve diğerleri aşağıda açıklanan1,2, 3 , 4 , 8 , 9: (i) solid tümör çoğunlukla kurulan hücrelerde apoptoz X x-ray kaynaklı bir kaç gün sonra ışınlama oluşur. (ii) X-x-ray kaynaklı Mitotik felaket kanser hücrelerinde oluşur en belirgin ikinci veya üçüncü mitoz serbest bırakmak–dan geçici hücre döngüsü tutuklama sonra ışınlama tarafından indüklenen. Belgili tanımlık serbest bırakmak genellikle yaklaşık 24 saat takip ışınlama sonra ortaya çıkar yaklaşık 24 h (III) aralıklarla tekrarlanan mitoses tarafından X-ray-indüklenen hücresel yaşlanma söz konusu hücre kültürünü bağımlı bir zaman aralığından sonra belli olur: 2 gün sonra Işınlama için bazı erken durumlarda ve 7 gün sonra ışınlama çoğu hücre hatları için. Klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre genel bir resim ölüm profilleri üzerinden başlangıç tarama elde ettikten sonra zaman ders deneyler en yoğun zaman belirli hücre satır ve/veya durumu klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölümü her modu için daha ayrıntılı bir aydınlatma sağlar faiz4.
Bu tahlil ve klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hayatta kalma tahlil boyama DAPI, radyasyon duyarlılık değerlendirmesi için altın standart yöntem değildir değiştirilebilir olması gerekmektedir. Apoptozis ve Mitotik felaket sadece son saat için. Böylece, bir zaman noktası için tahlil boyama DAPI Apoptozis ve değerlendirme zaman noktada oluşur Mitotik felaket algılar. Öte yandan, belirli bir zamanda noktası dahil toplam tutarı Apoptozis ve genellikle 10-14 gün sonra ışınlama gerçekleşmişti için kuluçka döneminde Mitotik felaket klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hayatta kalma sonuçlarını tahlil. Apoptozis ve Mitotik felaket, senescent hücreler farklı kültür çanak üzerinde kalır; onlar yavaş yavaş ışınlama sonra zamanla birikir. Bu nedenle, her ikisi de sonuçlarını tahlil ve klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hayatta kalma tahlil boyama DAPI kuluçka dönemi sırasında oluştu yaşlanma toplam tutarı yansıtır. Önemlisi, Apoptozis, Mitotik felaket ve ışınlama tarafından indüklenen yaşlanma oranı çok hücre göre farklılık gösteriyorsa çizgi ve ışınlama dozu. Birlikte ele alındığında, teorik olarak, bir tahlil sonuçlarını doğrudan o diğer tahlil çevrilemez.
Tahlil boyama DAPI birkaç sınırlaması vardır. İlk olarak, Mitotik felaket hücre ölümü farklı bir mod olup tartışmalı kalır. Radyasyon Biyoloji alanında, Mitotik felaket klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölüm1diğer mekanizmaları farklıdır IR indüklenen hücre ölümü büyük bir modu olarak kabul edilir. Öte yandan, diğerleri Mitotik o felaket hücre ölümü ancak13,14Apoptozis ve nekroz dahil olmak üzere hücre ölüm önce gelir bir süreç oldukça farklı bir mod değildir savunuyorlar. Böylece, Apoptozis ve Mitotik felaket bir ölçüde çakışabilir. İkincisi, önceki çalışmalar hücresel yaşlanma bazı hücre satırları ve tedavi ayarları2SAHF, yokluğunda meydana gelebilir öneririz. Her klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre için özel olarak tasarlanmış mevcut, diğer deneyleri, ölüm modu belirli bir deney sonuçlarını sağlamlığı artırmak için kullanılmalıdır. Üçüncü olarak, DAPI tahlil boyama modları klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölümü Apoptozis, Mitotik felaket ve hücresel yaşlanma (örneğin, nekroz ve autophagy) dışındaki değerlendirmek değildir. Dördüncü olarak, tümör yanıt radyoterapi için bir tahmin olarak tahlil boyama DAPI yarar klinikte aydınlatılmamıştır değil. Bu bakış açısından klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölümü toplam miktarı değerlendiriyor, klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hayatta kalma tahlil bir korelasyon SF2, hücreleri ile 2 Gy radyasyona maruz kalan kısmını arasında kurulan çünkü tahlil boyama DAPI üstündür X-ışınları ve radyoterapi15tümör yanıtı. Yine de, bu klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hayatta kalma tahlil yaygın klinikte özellikle yüksek derecede uzmanlık ve zaman (Yani, 14 gün) uzun bir süre için gereklilik nedeniyle veri toplama için kullanılmaktadır değil ki dikkat çekicidir. Buna karşılık, yordamı tahlil boyama DAPI için basit ve önemli ölçüde sonuçlar üretmek için daha az zaman, yaklaşık 3-4 gün sürer. DAPI boyama yardımcı programıtahlil tümör yanıt radyoterapi için bir tahmin olarak klinikte yakın gelecekte test edilecektir.
Özetle, tahlil boyama DAPI aynı anda üç büyük modu IR kaynaklı klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölümü değerlendirmek için bir düşük maliyetli tek adımlı tahlil olduğunu. Bu yaklaşım bir kolayca klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölümü için çeşitli hücre hatları, tedavi ayarları ve zaman puan, modları hücre ölümü mekanizmaları hedef hücreleri ve vade farkı şartları elucidating amacı ile için ekran izin verir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bayan Akiko Shibata teknik yardım için teşekkür ederiz. Bu eser önde gelen Enstitüler, ağır iyon Therapeutics ve mühendislik Global liderleri yetiştirilmesi için programlar için Milli Eğitim Bakanlığı, kültür, spor, bilim ve teknoloji Japonya dan Grants-in-Aid tarafından desteklenmiştir.
Materials
| cover slip | Matsunami | C013001 | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | |
| sucrose | Sigma-Aldrich | 84097-250G | |
| phosphate-buffered saline | Cosmo Bio | 16232000 | |
| scalpel | Kai Medical | No.20, 520-A | |
| 35 mm cell culture dish | Falcon | 353001 | |
| trypsin | Wako | 201-16945 | |
| inverted phase microscope | Shimazu | 114-909 | |
| X-ray irradiator | Faxitron Bioptics | Faxitron RX-650 | |
| square culture dish | Corning | 431110 | |
| slide glass | Matsunami | Pro-11 | |
| DAPI staining reagent | Cell Signaling | 8961S | |
| fluorescence microscope | Nikon | ECLIPSE Ni | |
| fluorescence microscope DAPI filter | Nikon | U-FUW, BP340-390, BA420IF, DM410 | |
| fluorescence microscope lens (20×) | Nikon | Plan Apo λ 20X/0.75 | |
| fluorescence microscope lens (60×, oil) | Nikon | Plan Apo λ 60X/1.40 oil | |
| oil | Olympus | N5218600 | |
| CCD camera | Nikon | DS-Qi2 | |
| digital image acquisition software | Nikon | NIS-Elements Document | |
| lens cleaner | Olympus | OT0552 | |
| chloroform | Wako | 035-02616 |
References
- Wouters, B. G., Joiner, M. C., van der Kogel, A. J. Cell death after irradiation: how, when and why cells die. Basic Clinical Radiobiology. 4th ed. , 27-40 (2009).
- Aird, K. M., Zhang, R. Detection of senescence-associated heterochromatin foci (SAHF). Methods Mol. Biol. 965, 185-196 (2013).
- Kobayashi, D., et al. Mitotic catastrophe is a putative mechanism underlying the weak correlation between sensitivity to carbon ions and cisplatin. Sci. Rep. 7, 40588 (2017).
- Amornwichet, N., et al. Carbon-ion beam irradiation kills X-ray-resistant p53-null cancer cells by inducing mitotic catastrophe. PLoS One. , 115121 (2014).
- Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nat. Protoc. 2, 2276-2284 (2007).
- Sawai, Y., et al. Effectiveness of sulforaphane as a radiosensitizer for murine osteosarcoma cells. Oncol. Rep. 29, 941-945 (2013).
- Cummings, B. S., Wills, L. P., Schnellmann, R. G. Measurement of cell death in mammalian cells. Curr. Protoc. Pharmacol. , (2012).
- Oike, T., et al. C646, a selective small molecule inhibitor of histone acetyltransferase p300, radiosensitizes lung cancer cells by enhancing mitotic catastrophe. Radiother. Oncol. 111, 222-227 (2014).
- Oike, T., et al. A synthetic lethality-based strategy to treat cancers harboring a genetic deficiency in the chromatin remodeling factor BRG1. Cancer Res. 73, 5508-5518 (2013).
- Russo, A. L., et al. In vitro and in vivo radiosensitization of glioblastoma cells by the poly (ADP-ribose) polymerase inhibitor E7016. Clin. Cancer Res. 15, 607-612 (2009).
- Di Micco, R., et al. Interplay between oncogene-induced DNA damage response and heterochromatin in senescence and cancer. Nat. Cell Biol. 13, 292-302 (2011).
- Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nat. Protoc. 1, 2315-2319 (2006).
- Vakifahmetoglu, H., Olsson, M., Zhivotovsky, B. Death through a tragedy: mitotic catastrophe. Cell Death Differ. 15, 1153-1162 (2008).
- Imreh, G., Norberg, H. V., Imreh, S., Zhivotovsky, B. Chromosomal breaks during mitotic catastrophe trigger γH2AX-ATM-p53-mediated apoptosis. J. Cell Sci. 129, 1950 (2016).
- Torres-Roca, J. F. A molecular assay of tumor radiosensitivity: a roadmap towards biology-based personalized radiation therapy. Per. Med. 9, 547-557 (2012).
