蛍光顕微鏡による放射線誘発的なクローン細胞死のモードの評価のためのワンステップ プロトコル

1 材料準備 オートクレーブ カバー スリップ。。 ガラス ビーカーにカバー スリップを配置します。 箔ガラス ビーカーをカバーします。 20 分 15 psi で 121 ° c のオートクレーブ 文化フードに室温で 50 ° C の店でドライ。 固定の解決の準備: 3% パラホルムアルデヒド + 2% のショ糖リン酸緩衝生理食塩水 (PBS). 1,000 mL ガラス瓶 700 mL の PBS と 30 g パラホルムアルデヒドを追加します 。 注意: パラホルムアルデヒドは腐食性、適切な手袋を着用します。 電子レンジを使用して 80 ° C の加熱により完全にディゾルブ パラホルムアルデヒド 。 注意: パラホルムアルデヒド煙は有毒なマスクを着用しています。 常温で一晩おきます。 20 g ショ糖を追加します。 合計ボリューム 1 に PBS を追加・ l ・ 因数 50 mL のチューブ。-20 ° C で 3 年間または 4 で 3 ヶ月間の固定の解決を格納できる ° C 2。細胞培養の準備 注: 文化フードでこれらの手順を実行する必要があります。 対数増殖 5 を維持するために 文化と通路 U2OS ひと骨肉腫細胞 。 注: 他のセルタイプは最適な照射線量を決定した後使用できます。 では、70% エタノールで湿らせた紙タオルでメスを拭いてください。35 mm 細胞培養ディッシュ上カバー スリップを配置、メスを使用して (以下単と呼ばれる " 皿 "). 注意: カバー スリップ一皿の数は実験によると増加することができます設計 (議論を参照). 追加 1 mL 文化メディア: 10% 牛胎児血清を DMEM 。 注: 他のメディアは、選択したセルの種類によると使用できます。 ペーパー タオル鉗子 ワイプは、70% エタノールで湿らせた。カバー スリップの中心を保持鉗子を使用して、優しく。カバー スリップの上でホールドを維持しながら、完全にお皿から培地を吸引します 。 ​ 注: この手順は、皿にカバー スリップの固定化を促進する。 トリプシン 5 を使用して付着性の培養されたセルをデタッチします。 皿から培地を吸引します。 1 mL の PBS を加えるし、料理を振盪します。 皿から吸い出しなさい PBS。 皿に 1 mL のトリプシン [0.25w/v% L 1mmol/トリプシン EDTA] を追加します。 5% CO 2 を含む大気中で 37 ° C で 5 分間加温。 皿に 9 mL の培地を追加します。 1000 μ L マイクロ ピペットを使用して単一細胞懸濁液を準備します。 5 セルをカウントします。 1.5 mL チューブ追加 0.9 mL 細胞懸濁液、0.1 mL 0.4% トリパン ブルー溶液。 診断に適用 10 μ L. の数を調べて逆位相顕微鏡下で細胞 (すなわち、ライブ) を無染色します。 15 mL チューブ、0.5 × 10 5 セル/ml の密度で培養液で 3 mL の細胞懸濁液を準備します 。 注: セルの実験によると密度を変更ことができます必要が (議論 を参照してください). 皿に細胞懸濁液 2 mL をそっと追加します。 5% CO 2 を含む大気中で 37 ° C で一晩加温します。 3。照射 注意: 製造業者に従って慎重に x 線照射を扱う ' の指示。 は、逆位相顕微鏡下で細胞を検査します。カバー スリップし、生きている細胞が接続されていることを確認します。 6 Gy の x 線が付いている皿を照射 (1.4 Gy/分、300 KVP、20 mA). 37 ° c 5% CO 2 を含む大気中で 72 時間 加温します 。 注: インキュベーション時間は実験によると変更することができます設計 (議論 を参照). 4。固定 お皿から培地を吸引します。 使用のはさみ、1,000 μ L ピペットの先端をカット、端から 5 mm をヒントします 。 注: カットのヒント スムーズに固定の解決を適用することができます。 皿の側の壁から皿に 1 mL (1.2 の手順で準備) の固定の解決を追加カットの先端を使用しています 。 注: この手順は、時間に敏感なしたがって複数のサンプルを処理するとき、マイクロ ピペットのヒントを変更することがなく実行する必要があります。皿の底に直接固定ソリューションのアプリケーションは、細胞を損傷することができます。 は、正方形の培養皿に料理を配置します。カバー スリップ上固定ソリューションを均等に優しく正方形の培養皿を振る。 室温で 10 分間加温。 皿から固定の解決を吸い出しなさい。 は、皿の側の壁から皿に 2 mL の PBS を追加します 。 注: PBS のアプリケーションを皿の底に直接細胞を損傷することができます。 皿から吸い出しなさい PBS。 4.7 ・ 4.8 2 回手順を繰り返します 。 注: 料理と共に格納できます 4 ° C で 1 週間に 2 mL の PBS を浴びてカバー スリップ。 5。DAPI 染色 スライド ガラスに適用 5 μ L 1 G/ml DAPI 染色試薬 。 注: DAPI 染色試薬が格納されている場合、6 ヶ月間安定した-20 以下の光から保護された ° C 皿からカバー スリップを削除、メスを使用しています。 ペーパー タオルでカバー スリップの端に触れることによりカバー スリップ上余分な PBS をオフ描画します。 マウント カバー スリップ セルが DAPI 染色試薬にさらされているので、スライド グラス上で試薬を汚す DAPI のドロップに逆さまにします 。 注: この手順は、時間に敏感なです。最適な汚染につながることができます染色試薬、DAPI の乾燥します。 サンプルは-20 で 1 年保存できる ° C 6。画像取得 検査蛍光顕微鏡のサンプル。核は DAPI フィルターを使用して、視覚化します 。 注: いずれか 20 X、60 X オイル レンズは、研究者によると使用することができます ' s 関心。60 X オイル レンズを使用している場合は、カバー スリップの上に油の 1 滴を追加します。サンプルはレンズを触れないでください。 注意してください。それ以外の場合、レンズを破損ことができます。 CCD カメラとデジタル画像集録ソフトウェアを使用して、次の設定とパラメーターを持つ核の画像を取得: 1 X、および自動露出の DAPI フィルター、単分子膜のイメージを得る。 フィニッシュ画像取得: 20 X レンズ クリーナー レンズで湿らせたペーパー タオルで拭く。クロロホルムで湿らせたペーパー タオルで油レンズ X 60 を拭く。 7。クローン細胞死モードの評価 ランダムに選択された画像でカウント核の合計数が 300 に到達するまで、アポトーシス、細胞分裂の大惨事、細胞の老化に条件を満たす核の数をカウントします。各実験的設定の 3 通のこのステップを実施します。 Apoptosis のための条件: アポトーシス体 (すなわち、凝縮と断片化した核) 6 、 7 の存在。 分裂の大惨事の 条件: 2 つ以上の異なる葉または micronucl を示す核の存在ei 8 , 9 , 10. 細胞の老化のための基準: 老化関連ヘテロクロマチン巣 (SAHF) (すなわち 30-50 の明るい、高密度の巣を含んでいる核 DNA) の存在 2 , 11。