One-Step protocollo per la valutazione del modo di morte indotta da radiazioni delle cellule Clonogenic da microscopia di fluorescenza
Summary
Ricerca sulle radiazioni ionizzanti (IR)-indotto clonogenic delle cellule morte è importante per comprendere gli effetti della IR su tumori maligni e tessuti normali. Qui, descriviamo un saggio di uno stadio per valutare i modi principali di morte cellulare indotta da IR clonogenic basata sulla morfologia di 4′, 6-diamidino-2-phenylindole dicloridrato (DAPI)-macchiato i nuclei visualizzati da microscopia di fluorescenza.
Abstract
Ricerca sulle radiazioni ionizzanti (IR)-indotto clonogenic delle cellule morte è importante per comprendere l’effetto di IR su tumori maligni e tessuti normali. Qui, descriviamo un saggio di una tappa veloce ed economica per valutare simultaneamente i modi principali di clonogenic morte cellulare indotta da IR, cioè, apoptosi, catastrofe mitotica e senescenza cellulare. In questo metodo, le cellule coltivate su un vetrino coprioggetto sono irradiate con raggi x e macchiate con 4′, 6-diamidino-2-phenylindole dicloridrato (DAPI). Usando la microscopia di fluorescenza, apoptosi, catastrofe mitotica e senescenza cellulare vengono identificati in base sulle morfologie caratteristiche dei nuclei DAPI-macchiato. L’apoptosi è determinata dalla presenza di corpi apoptotici (cioè, nuclei condensati e frammentati). Catastrofe mitotica è determinata dalla presenza di nuclei che presentano due o più distinti lobi e micronuclei. La senescenza cellulare è determinata dalla presenza di senescenza-collegata heterochromatic fuochi (cioè, DNA nucleare che contiene i fuochi di brillanti, densi di 30-50). Questo approccio consente lo sperimentatore allo schermo facilmente per modalità di morte delle cellule clonogenic utilizzando varie linee cellulari, impostazioni di trattamento e/o punti di tempo, con l’obiettivo di chiarire i meccanismi di morte cellulare nelle cellule bersaglio le condizioni di interesse.
Introduction
Radiazioni ionizzanti (IR) induce i modi multipli di morte delle cellule clonogenic. La ricerca sulla morte cellulare indotta da IR clonogenic è importante per capire la tossicità di IR ai tessuti normali, così come per lo sviluppo di metodi per aumentare l’efficacia del trattamento di radioterapia del cancro. Apoptosis, catastrofe mitotica e senescenza cellulare sono i modi principali di clonogenic morte cellulare indotta da IR1. L’apoptosi è una modalità regolamentata di morte delle cellule che è iniziata dal DNA danni1. Catastrofe mitotica è la morte delle cellule che si verifica a causa di mitosi aberrante derivanti da unrepaired del DNA double-strand break1. La senescenza cellulare è definita come uno stato di irreversibile delle cellule crescita arresto2; Si noti che la senescenza cellulare non è la morte delle cellule per sé, ma è una modalità di morte delle cellule clonogeniche perché esso abolisce la sopravvivenza clonogenic della cella senescente.
Varie analisi cell-based sono state sviluppate per valutare individualmente apoptosi, catastrofe mitotica e senescenza cellulare. L’apoptosi può essere valutata dal terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end etichettatura (TUNEL) colorazione, colorazione di annessina V, test di frammentazione del DNA e sub-G1 ciclo cellulare fase determinazione di flusso cytometry1. Catastrofe mitotica può essere valutata dall’immunofluorescenza che macchia per indicatori mitotici, compreso MPM2, macchiatura TUNEL e la microscopia elettronica1. Senescenza cellulare può essere valutata dalla macchiatura di β-galattosidasi senescenza-collegata (SA-β-gallone), saggi di arresto di crescita e di microscopia elettronica1. D’importanza, la modalità predominante della morte delle cellule clonogeniche differisce tra linee cellulari e trattamento impostazioni3,4. Pertanto, per delucidare il profilo complessivo di morte delle cellule clonogeniche per una determinata impostazione sperimentale, saggi multipli che copre tutte queste modalità di morte devono essere condotta insieme, che è ad alta intensità di manodopera e di costi.
In questo articolo, descriviamo un saggio di una tappa veloce ed economica per valutare simultaneamente apoptosi, catastrofe mitotica e senescenza cellulare indotta da IR3,4. In questo metodo, le cellule coltivate su un vetrino coprioggetto sono irradiate con raggi x e macchiate con 4′, 6-diamidino-2-phenylindole dicloridrato (DAPI). Usando la microscopia di fluorescenza, apoptosi, catastrofe mitotica e senescenza cellulare sono identificati ciascuno basato sulle rispettive morfologie caratteristiche dei nuclei DAPI-macchiato. Questo approccio sarà utile per le applicazioni tra cui la selezione per profili clonogenic delle cellule morte in varie linee cellulari, ambienti terapeutici e punti di tempo, con l’obiettivo di indagare i meccanismi della morte cellulare nelle cellule bersaglio e condizioni di interesse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Di seguito sono riportati i passaggi critici all’interno del protocollo. In primo luogo, le cellule devono essere coltivate su piastra di coltura come uno strato monomolecolare perché una valutazione morfologica di DAPI-ha macchiato i nuclei è difficile per le celle multilivello. A tal fine, al punto 2.9, si raccomanda attenzione trasferimento di piastra di coltura in un’incubatrice; agitazione del piatto cultura genera un turbinio di cellule sospese che porta alla concentrazione di cellule al centro della piastra di coltura. Inoltre, overconfluence che conduce alle celle multilivello dovrebbe essere evitato. A tal fine, al punto 2.7, il numero delle cellule seminate su piastra di coltura può essere modificato basato sul tempo e l’intervallo tra l’irradiazione e la fissazione di raddoppiamento della popolazione. È consigliabile una confluenza di circa 80 al momento della fissazione. In secondo luogo, la velocità è importante nella fissazione e colorazione DAPI (cioè, i passaggi 4 e 5). Inter-campione incoerenza per quanto riguarda il tempo impiegato per questi passaggi può condurre all’eterogeneità nell’intensità del segnale DAPI nei nuclei, che potrebbe oscurare la valutazione morfologica.
Al punto 2.2, si può aumentare il numero di vetrini in un piatto di sola cultura; un massimo di quattro vetrini può essere collocato in un piatto di 35 mm, e il numero può essere ulteriormente aumentato utilizzando piatti più sostanziosi. Immissione più vetrini coprioggetto in ogni piatto di cultura consente il funzionamento efficiente di valutazione del corso di tempo per un dato trattamento (cioè, il coperchio scivola possa essere raccolti da una piastra di coltura uno per uno in più momenti di interesse).
Al punto 3.2, la dose di irradiazione può essere modificata secondo l’interesse dei ricercatori. L’applicazione di una dose costante di linee cellulari multiple consente il confronto della sensibilità per ogni modalità di morte delle cellule clonogeniche tra le linee cellulari. D’altra parte, l’uso di dosi di sopravvivenza clonogenic iso per ogni linea cellulare consente il confronto dei profili di morte delle cellule clonogeniche tra le linee cellulari. La dose di sopravvivenza clonogenic iso può essere determinata dalla sopravvivenza clonogenic assay12. Il valore di10 D, la dose che fornisce 10% sopravvivenza clonogenic, è un punto finale comune per la dose di sopravvivenza clonogenic iso.
Al punto 3.3, il tempo da irradiazione di fissazione può essere modificato secondo l’interesse dei ricercatori; Questo è importante perché il tempo di picco per apoptosi indotta da IR, catastrofe mitotica e senescenza cellulare varia secondo trattamento e linea cellulare. In questo articolo, abbiamo usato 72 h dopo irradiazione come il punto di tempo che sarebbe più utile per lo screening iniziale dei profili di morte delle cellule clonogeniche, basato su studi multipli dal nostro gruppo e altri descritto come segue1,2, 3 , 4 , 8 , 9: (i) X-ray-indotta apoptosi in cellule stabilite da tumori solidi per la maggior parte si verifica un paio di giorni dopo irradiazione. (ii) catastrofe mitotica X-ray-indotta in cellule di cancro si verifica più prominente al secondo o terzo mitosi dopo il rilascio dall’arresto temporaneo ciclo cellulare indotta da irradiazione. Il rilascio avviene di solito circa 24 h dopo irradiazione, seguita dalla mitosi ripetute ad intervalli di circa 24 h. (iii) X-ray – indotta senescenza cellulare diventa evidente dopo un intervallo dipende la linea cellulare in questione: 2 giorni dopo irradiazione per alcuni casi in anticipo e 7 giorni dopo irradiazione per la maggior parte delle linee cellulari. Dopo aver ottenuto un quadro complessivo della cella clonogenic profili di morte lo screening iniziale, tempo corso esperimenti forniranno una delucidazione più dettagliata del tempo di picco per ciascun modo di morte delle cellule clonogenic in linea cellulare specifica e/o condizione di di interesse4.
Si deve osservare che il DAPI colorazione dosaggio e l’analisi di sopravvivenza clonogenic, metodo gold standard per la valutazione di sensibilità di radiazione, non sono intercambiabili. Apoptosi e catastrofe mitotica solo durare per ore. Così, il dosaggio per un punto dato tempo di colorazione DAPI rileva apoptosi e catastrofe mitotica, che si verifica nel punto di volta della valutazione. D’altra parte, i risultati della sopravvivenza clonogenic assay in un dato momento punto includono la quantità totale di apoptosi e catastrofe mitotica che si era verificato durante il periodo di incubazione, in genere 10-14 giorni dopo l’irradiazione. Diverso da apoptosi e catastrofe mitotica, cellule senescenti rimangono sulla piastra di coltura; si accumulano gradualmente nel tempo dopo irradiazione. Pertanto, i risultati di entrambi il DAPI colorazione dosaggio e l’analisi di sopravvivenza clonogenic riflette l’importo totale della senescenza che si è verificato durante il periodo di incubazione. D’importanza, la proporzione di apoptosi, catastrofe mitotica e senescenza indotta da irradiazione varia notevolmente secondo la cella linea e irradiazione della dose. Presi insieme, teoricamente, i risultati di un test non possono essere convertiti direttamente in quelli di altri test.
Il dosaggio di colorazione DAPI ha alcune limitazioni. In primo luogo, resta controverso se catastrofe mitotica è una modalità distinta della morte delle cellule. Nel campo della biologia di radiazione, catastrofe mitotica è considerata una modalità principali di morte cellulare indotta da IR che è distinta da altri meccanismi di clonogenic delle cellule morte1. D’altra parte, altri sostengono che catastrofe mitotica non è una modalità distinta di morte delle cellule, ma piuttosto un processo che precede la morte delle cellule, tra cui l’apoptosi e necrosi13,14. Così, l’apoptosi e la catastrofe mitotica possono sovrapporsi in una certa misura. Precedenti, secondo gli studi suggeriscono che la senescenza cellulare può verificarsi in assenza di SAHF in alcune linee cellulari e trattamento impostazioni2. Al presente, altri saggi appositamente per ogni cella clonogenic morte modalità deve essere utilizzata per aumentare la robustezza delle conclusioni di un esperimento dato. In terzo luogo, il dosaggio di colorazione DAPI non può valutare modi di morte delle cellule clonogeniche diverso da apoptosi, catastrofe mitotica e senescenza cellulare (ad es., la necrosi e l’autofagia). In quarto luogo, l’utilità di DAPI macchiatura saggio come un predittore di risposta del tumore alla radioterapia non è stata chiarita nella clinica. Da questo punto di vista, l’analisi di sopravvivenza clonogenic, che valuta la quantità totale di morte delle cellule clonogeniche, è superiore al DAPI macchiatura saggio perché è stata stabilita una correlazione tra SF2, la frazione sopravvivente di cellule irradiate con 2 Gy I raggi x e la risposta del tumore alla radioterapia15. Tuttavia, è interessante nota che l’analisi di sopravvivenza clonogenic non è utilizzata ampiamente nella clinica, principalmente a causa del requisito per un elevato grado di competenza e un lungo periodo di tempo (cioè, 14 giorni) per l’acquisizione dati. In confronto, la procedura per il dosaggio di colorazione DAPI è più semplice e richiede significativamente meno tempo, circa 3-4 giorni, per generare i risultati. L’utilità della colorazione DAPIanalisi come un predittore di risposta del tumore alla radioterapia sarà testato in clinica nel prossimo futuro.
In sintesi, il dosaggio di colorazione DAPI è un dosaggio di conveniente One-Step per valutare simultaneamente i tre modi principali di morte cellulare indotta da IR clonogenic. Questo approccio permette facilmente dello schermo per le modalità della morte delle cellule clonogeniche per varie linee cellulari, ambienti terapeutici e punti di tempo, con l’obiettivo di chiarire i meccanismi di morte cellulare nelle cellule bersaglio le condizioni di interesse.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo la signora Akiko Shibata per assistenza tecnica. Questo lavoro è stato supportato da localizzativi dal Ministero della pubblica istruzione, cultura, sport, scienza e tecnologia del Giappone per i programmi per scuole laureate leader, coltivando Global Leaders in ingegneria e pesante dello ione Therapeutics.
Materials
| cover slip | Matsunami | C013001 | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | |
| sucrose | Sigma-Aldrich | 84097-250G | |
| phosphate-buffered saline | Cosmo Bio | 16232000 | |
| scalpel | Kai Medical | No.20, 520-A | |
| 35 mm cell culture dish | Falcon | 353001 | |
| trypsin | Wako | 201-16945 | |
| inverted phase microscope | Shimazu | 114-909 | |
| X-ray irradiator | Faxitron Bioptics | Faxitron RX-650 | |
| square culture dish | Corning | 431110 | |
| slide glass | Matsunami | Pro-11 | |
| DAPI staining reagent | Cell Signaling | 8961S | |
| fluorescence microscope | Nikon | ECLIPSE Ni | |
| fluorescence microscope DAPI filter | Nikon | U-FUW, BP340-390, BA420IF, DM410 | |
| fluorescence microscope lens (20×) | Nikon | Plan Apo λ 20X/0.75 | |
| fluorescence microscope lens (60×, oil) | Nikon | Plan Apo λ 60X/1.40 oil | |
| oil | Olympus | N5218600 | |
| CCD camera | Nikon | DS-Qi2 | |
| digital image acquisition software | Nikon | NIS-Elements Document | |
| lens cleaner | Olympus | OT0552 | |
| chloroform | Wako | 035-02616 |
References
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