One-Step-Protokoll für die Bewertung des strahleninduzierten klonogenen Zelltod durch Fluoreszenz-Mikroskopie-Modus
Summary
Forschung auf ionisierende Strahlung (IR)-induzierte klonogenen Zelltod ist wichtig für das Verständnis der Auswirkungen der IR auf bösartigen Tumoren und normalem Gewebe. Hier beschreiben wir eine One-Step-Assay für die Beurteilung der Hauptmodi der klonogenen IR-induzierte Zelltod anhand der Morphologie der 4′, 6-Diamidino-2-Phenylindole Dihydrochloride (DAPI)-gefärbten Kernen durch Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht.
Abstract
Forschung auf ionisierende Strahlung (IR)-induzierte klonogenen Zelltod ist wichtig für das Verständnis der Wirkung von IR auf bösartigen Tumoren und normalem Gewebe. Hier beschreiben wir eine schnell und kostengünstig ein-Schritt-Assay für die Beurteilung der gleichzeitig die Hauptmodi der klonogenen Zelltod durch IR, d. h., Apoptose, mitotischen Katastrophe und zelluläre Seneszenz induziert. Bei dieser Methode werden Zellen auf einem Deckglas angebaut mit Röntgenstrahlen bestrahlt und befleckt mit 4′, 6-Diamidino-2-Phenylindole Dihydrochloride (DAPI). Mit Fluoreszenz-Mikroskopie, werden mitotischen Katastrophe, Apoptose und zelluläre Seneszenz identifiziert anhand der charakteristischen Morphologien der DAPI-gefärbten Zellkerne. Apoptose ist durch das Vorhandensein des apoptotischen Körper (d. h., verdichtet und fragmentierten Kernen) bestimmt. Mitotische Katastrophe richtet sich nach der Anwesenheit von Kernen, die zwei oder mehr unterschiedliche Lappen und Mikrokerne aufweisen. Zelluläre Seneszenz wird durch das Vorhandensein von Seneszenz-assoziierten heterochromatischen Brennpunkte (d. h.Kern-DNA mit 30-50 helle, Dichte Herde) bestimmt. Dieser Ansatz ermöglicht den Experimentator leicht für klonogenen Zelle Tod Modi mit verschiedenen Zelllinien, Behandlung-Einstellungen und/oder Zeitpunkten, mit dem Ziel der Aufklärung der Mechanismen des Zelltods in den Zielzellen von Interesse auf den Bildschirm.
Introduction
Ionisierende Strahlung (IR) induziert mehrere Modi des klonogenen Zelltods. Forschung auf IR-induzierte klonogenen Zelltod ist wichtig für das Verständnis der Toxizität von IR zu normalen Geweben, als auch für die Entwicklung von Methoden zur Steigerung der Wirksamkeit der Behandlung von Krebs Strahlentherapie. Apoptose, mitotischen Katastrophe und zelluläre Seneszenz sind die Hauptmodi der klonogenen Zelltod durch IR1induziert. Apoptose ist eine regulierte Zelltod, der durch DNA-Schäden1initiiert wird. Mitotische Katastrophe ist Zelltod, die aufgrund von aberranten Mitose infolge unrepaired DNA-Doppel-Strangbrüchen1auftritt. Zelluläre Seneszenz ist definiert als ein Zustand des irreversiblen Zelle Wachstum Verhaftung2; Beachten Sie, dass zelluläre Seneszenz nicht per se Zelltod ist, aber es eine Art der klonogenen Zelltod, ist weil es das klonogenen Überleben der alternde Zelle schafft.
Verschiedenen zellbasierte Assays wurden entwickelt, um Apoptose, mitotischen Katastrophe und zelluläre Seneszenz individuell zu beurteilen. Apoptose kann durch terminal Deoxynucleotidyl Transferase dUTP Nick-End Kennzeichnung (TUNEL) Färbung, annexin V Färbung, DNA-Fragmentierung Assays und Sub-G1 Zellzyklus Phase Bestimmung von Flow Cytometry1bewertet werden. Mitotische Katastrophe kann durch Immunfluoreszenz-Färbung für mitotischen Marker, einschließlich MPM2, TUNEL Färbung und Elektronenmikroskopie1bewertet werden. Zelluläre Seneszenz kann Seneszenz-assoziierten β-Galaktosidase (SA-β-Gal) Färbung, Wachstum-Festnahme-Assays und Elektronenmikroskopie1bewertet werden. Wichtig ist, unterscheidet sich die vorherrschende Art der klonogenen Zelltod unter Zelllinien und Behandlung Einstellungen3,4. Daher müssen um das Gesamtprofil der klonogenen Zelltod für eine bestimmte experimentelle Einstellung zu erhellen, mehrere Tests für alle diese Modi des Todes gemeinsam durchgeführt werden ist arbeitsintensiv und Kosten.
In diesem Artikel beschreiben wir einen schnelle und kostengünstige einstufige Assay für gleichzeitig Beurteilung von Apoptose, mitotischen Katastrophe und zelluläre Seneszenz induziert durch IR3,4. Bei dieser Methode werden Zellen auf einem Deckglas angebaut mit Röntgenstrahlen bestrahlt und befleckt mit 4′, 6-Diamidino-2-Phenylindole Dihydrochloride (DAPI). Mit Fluoreszenz-Mikroskopie, sind mitotischen Katastrophe, Apoptose und zelluläre Seneszenz jeder identifiziert anhand der jeweiligen charakteristischen Morphologien der DAPI-gefärbten Zellkerne. Dieser Ansatz wird für Anwendungen einschließlich Screening für klonogenen Zelle Tod Profile in verschiedenen Zelllinien, Behandlung Einstellungen und Zeitpunkten, mit dem Ziel der Untersuchung der Mechanismen des Zelltods in den Zielzellen und Nutzungsbedingungen hilfreich sein. Interesse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die entscheidenden Schritte innerhalb des Protokolls sind wie folgt. Erstens sollten Zellen in der Kulturschale als eine Monolage angebaut werden, weil eine morphologische Beurteilung des DAPI-gefärbten Kernen für mehrschichtige Zellen schwierig ist. Zu diesem Zweck im Schritt 2,9 wird vorsichtig Transfer von der Kulturschale in einem Inkubator empfohlen; von der Kulturschale schütteln erzeugt einen Wirbel von suspendierten Zellen, der die die Konzentration der Zellen in der Mitte der Kulturschale führt. Darüber hinaus sollte die Overconfluence führt zu mehrschichtigen Zellen vermieden werden. Zu diesem Zweck im Schritt 2.7 kann die Anzahl der Zellen in der Kulturschale ausgesät geändert werden, gemessen an der Bevölkerungszahl, die Verdoppelung der Zeit und das Intervall zwischen Bestrahlung und Fixierung. Ein Zusammenfluss von ca. 80 zum Zeitpunkt der Fixierung wird empfohlen. Zweitens ist die Geschwindigkeit wichtig, Fixierung und DAPI-Färbung (d. h., die Schritte 4 und 5). Inter Probe Inkonsistenz im Hinblick auf den Zeitaufwand für diese Schritte führen zu Heterogenität DAPI Signalintensität in den Kernen, die die morphologische Beurteilung verdecken würde.
Im Schritt 2.2 kann die Anzahl der Deckel rutscht in einer einzigen Kulturschale erhöht werden; maximal vier Deckel rutscht in einer 35-mm-Schale platziert werden kann, und die Zahl kann weiter erhöht werden, mit größeren Gerichten. Platzieren mehrere Deckel rutscht in jeder Kulturschale ermöglicht den effizienten Betrieb der Zeit Kurs Bewertung für eine bestimmte Behandlung (d. h., die Abdeckung, die rutscht der Kulturschale eins nach dem anderen zu mehreren Zeitpunkten von Interesse gesammelt werden können).
Im Schritt 3.2 kann die Bestrahlungsdosis nach der Forscher Interesse geändert werden. Die Anwendung einer einheitlichen Dosis auf mehrere Zelllinien ermöglicht den Vergleich von der Sensibilität für jeden Modus des klonogenen Zelltods bei der Zell-Linien. Auf der anderen Seite ermöglicht die Verwendung von Iso-klonogenen überleben Dosen für jede Zelllinie Vergleichung der klonogenen Zelle Tod Profile unter der Zell-Linien. Die Iso-klonogenen überleben Dosis kann durch die klonogenen überleben Assay12bestimmt werden. Der D-10 -Wert, die Dosis, die 10 % klonogenen überleben, bietet ist einen gemeinsamen Endpunkt für die Iso-klonogenen überleben Dosis.
Im Schritt 3.3 kann die Zeit zwischen Bestrahlung und Fixierung der Forscher Interesse angepasst werden; Dies ist wichtig, weil die Höchstzeit für IR-induzierte Apoptose, mitotischen Katastrophe und zelluläre Seneszenz je nach Zelllinie und Behandlung variiert. In diesem Artikel wir benutzten 72 h nach der Bestrahlung als der Zeitpunkt, der wäre sehr nützlich für die ersten Screening der klonogenen Zelle Tod Profile, basierend auf mehrere Studien von unserer Fraktion und andere beschrieben wie folgt1,2, 3 , 4 , 8 , 9: (i) X-ray-induzierten Apoptose in Zellen hergestellt aus soliden Tumoren meist tritt ein paar Tage nach der Bestrahlung. (Ii) X-ray-induzierten mitotischen Katastrophe in Krebszellen tritt am deutlichsten bei der zweiten oder dritten Mitose nach der Entlassung aus der temporären Zellzyklus Festnahme induziert durch Bestrahlung. Die Veröffentlichung tritt in der Regel ca. 24 h nach der Bestrahlung, gefolgt durch wiederholte Mitosen in Abständen von etwa 24 h. (Iii) X-Ray-induzierte zellulären Seneszenz wird offensichtlich nach einem Intervall hängt von der Zell-Linie in Frage: 2 Tage nach Bestrahlung für einige frühe Fälle und 7 Tage nach der Bestrahlung für den meisten Zelllinien. Nach Erstellung eines umfassenden Bildes der klonogenen Zelle Tod Profile aus dem ersten Screening, Zeit Kurs Experimente liefern eine detaillierte Aufklärung der Hauptzeit für jeden Modus des klonogenen Zelltods in den spezifischen Zelllinie und/oder Zustand des Interesse-4.
Es sei darauf hingewiesen, dass die DAPI-Färbung-Assay und der klonogenen Survival Test, eine Gold-Standard-Methode für Strahlung Empfindlichkeit Bewertung sind nicht austauschbar. Apoptose und mitotischen Katastrophe nur dauern Stunden. So erkennt das DAPI-Färbung Assay für einen bestimmten Zeitpunkt Apoptose und mitotischen Katastrophe, die zum Zeitpunkt der Bewertung erfolgt. Auf der anderen Seite bestimmen die Ergebnisse der klonogenen überleben zu einem bestimmten Zeitpunkt Punkt enthalten den Gesamtbetrag der Apoptose und mitotischen Katastrophe, die während der Inkubationszeit in der Regel 10-14 Tage nach der Bestrahlung stattgefunden hatte. Anders als bei Apoptose und mitotischen Katastrophe, alternde Zellen bleiben auf der Kulturschale; Sie reichern sich allmählich im Laufe der Zeit nach der Bestrahlung. Die Ergebnisse beider das DAPI-Färbung-Assay und der klonogenen Survival Test spiegeln den Gesamtbetrag der Seneszenz, die während der Inkubationszeit aufgetreten sind. Wichtig ist, der Anteil der Apoptose, mitotischen Katastrophe und Seneszenz induziert durch Bestrahlung variiert stark je nach Zelle Linie und Bestrahlung Dosis. Zusammengenommen können nicht theoretisch, die Ergebnisse eines Tests direkt in derjenigen der anderen Test übersetzt werden.
Das DAPI-Färbung Assay hat ein paar Einschränkungen. Erstens bleibt umstritten, ob mitotischen Katastrophe eine unterschiedliche Art von Zelltod ist. Im Bereich der Strahlenbiologie gilt mitotischen Katastrophe eine Dur IR-induzierte Zelltod, der sich von anderen Mechanismen der klonogenen Zelle Tod1unterscheidet. Auf der anderen Seite, argumentieren andere, dass die mitotische Katastrophe ist keine unterschiedliche Art der Zelltod, sondern ein Prozess, der Zelltod Apoptose und Nekrose13,14einschließlich vorausgeht. So können Apoptose und mitotischen Katastrophe teilweise überlappen. Zweite, frühere Studien deuten darauf hin, dass zelluläre Seneszenz bei fehlender SAHF in einigen Zelllinien und Behandlung Einstellungen2auftreten kann. Bei vorhanden, andere Tests, die speziell für die einzelnen klonogenen Zellen sollten Tod Modus verwendet werden, um die Robustheit der Schlussfolgerungen der ein bestimmtes Experiment zu erhöhen. Drittens: nicht das DAPI-Färbung Assay Modi des klonogenen Zelltods als Apoptose, der mitotischen Katastrophe und der zellulären Seneszenz (z.B., Nekrose und Autophagie) beurteilen. Viertens hat die Nützlichkeit der DAPI-Färbung Assay als Prädiktor des Tumor-Ansprechens auf Strahlentherapie in der Klinik nicht aufgeklärt. Unter diesem Gesichtspunkt ist der klonogenen überleben Test, dem den Gesamtbetrag der klonogenen Zelltod bewertet wird, überlegen, das DAPI-Färbung Assay, da eine Korrelation zwischen SF2, die Überlebenden Bruch der Zellen mit 2 Gy bestrahlt eingerichtet wurde Röntgenstrahlen, und die Tumor-Ansprechens auf Strahlentherapie15. Dennoch ist es bemerkenswert, dass der klonogenen überleben Assay nicht weit verbreitet in der Klinik, vor allem auf die Voraussetzung für ein hohes Maß an Kompetenz und eine längere Zeit (z. B.14 Tage) für die Datenerfassung genutzt wird. Zum Vergleich: das Verfahren für das DAPI-Färbung Assay ist einfacher und deutlich weniger Zeitaufwand, ca. 3-4 Tage, um Ergebnisse zu generieren. Das Dienstprogramm der DAPI-FärbungAssay als Prädiktor des Tumor-Ansprechens auf Strahlentherapie werden in naher Zukunft in der Klinik getestet werden.
Zusammenfassend ist das DAPI-Färbung Assay eine kostengünstige einstufige Assay gleichzeitig drei Hauptmodi der klonogenen IR-induzierte Zelltod zu beurteilen. Dieser Ansatz erlaubt es, leicht Bildschirm für die Modi des klonogenen Zelltods für verschiedene Zelllinien, Behandlung Einstellungen und Zeitpunkten, mit dem Ziel der Aufklärung der Mechanismen des Zelltods in den Zielzellen von Interesse.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Frau Akiko Shibata für technische Hilfe. Diese Arbeit wurde durch Grants-in-Aid vom Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie in Japan für Programme für Leading Graduate Schools, Anbau weltweit führend in schweren Ionen-Therapeutika und Engineering unterstützt.
Materials
| cover slip | Matsunami | C013001 | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | |
| sucrose | Sigma-Aldrich | 84097-250G | |
| phosphate-buffered saline | Cosmo Bio | 16232000 | |
| scalpel | Kai Medical | No.20, 520-A | |
| 35 mm cell culture dish | Falcon | 353001 | |
| trypsin | Wako | 201-16945 | |
| inverted phase microscope | Shimazu | 114-909 | |
| X-ray irradiator | Faxitron Bioptics | Faxitron RX-650 | |
| square culture dish | Corning | 431110 | |
| slide glass | Matsunami | Pro-11 | |
| DAPI staining reagent | Cell Signaling | 8961S | |
| fluorescence microscope | Nikon | ECLIPSE Ni | |
| fluorescence microscope DAPI filter | Nikon | U-FUW, BP340-390, BA420IF, DM410 | |
| fluorescence microscope lens (20×) | Nikon | Plan Apo λ 20X/0.75 | |
| fluorescence microscope lens (60×, oil) | Nikon | Plan Apo λ 60X/1.40 oil | |
| oil | Olympus | N5218600 | |
| CCD camera | Nikon | DS-Qi2 | |
| digital image acquisition software | Nikon | NIS-Elements Document | |
| lens cleaner | Olympus | OT0552 | |
| chloroform | Wako | 035-02616 |
References
- Wouters, B. G., Joiner, M. C., van der Kogel, A. J. Cell death after irradiation: how, when and why cells die. Basic Clinical Radiobiology. 4th ed. , 27-40 (2009).
- Aird, K. M., Zhang, R. Detection of senescence-associated heterochromatin foci (SAHF). Methods Mol. Biol. 965, 185-196 (2013).
- Kobayashi, D., et al. Mitotic catastrophe is a putative mechanism underlying the weak correlation between sensitivity to carbon ions and cisplatin. Sci. Rep. 7, 40588 (2017).
- Amornwichet, N., et al. Carbon-ion beam irradiation kills X-ray-resistant p53-null cancer cells by inducing mitotic catastrophe. PLoS One. , 115121 (2014).
- Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nat. Protoc. 2, 2276-2284 (2007).
- Sawai, Y., et al. Effectiveness of sulforaphane as a radiosensitizer for murine osteosarcoma cells. Oncol. Rep. 29, 941-945 (2013).
- Cummings, B. S., Wills, L. P., Schnellmann, R. G. Measurement of cell death in mammalian cells. Curr. Protoc. Pharmacol. , (2012).
- Oike, T., et al. C646, a selective small molecule inhibitor of histone acetyltransferase p300, radiosensitizes lung cancer cells by enhancing mitotic catastrophe. Radiother. Oncol. 111, 222-227 (2014).
- Oike, T., et al. A synthetic lethality-based strategy to treat cancers harboring a genetic deficiency in the chromatin remodeling factor BRG1. Cancer Res. 73, 5508-5518 (2013).
- Russo, A. L., et al. In vitro and in vivo radiosensitization of glioblastoma cells by the poly (ADP-ribose) polymerase inhibitor E7016. Clin. Cancer Res. 15, 607-612 (2009).
- Di Micco, R., et al. Interplay between oncogene-induced DNA damage response and heterochromatin in senescence and cancer. Nat. Cell Biol. 13, 292-302 (2011).
- Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nat. Protoc. 1, 2315-2319 (2006).
- Vakifahmetoglu, H., Olsson, M., Zhivotovsky, B. Death through a tragedy: mitotic catastrophe. Cell Death Differ. 15, 1153-1162 (2008).
- Imreh, G., Norberg, H. V., Imreh, S., Zhivotovsky, B. Chromosomal breaks during mitotic catastrophe trigger γH2AX-ATM-p53-mediated apoptosis. J. Cell Sci. 129, 1950 (2016).
- Torres-Roca, J. F. A molecular assay of tumor radiosensitivity: a roadmap towards biology-based personalized radiation therapy. Per. Med. 9, 547-557 (2012).
