البروتوكول خطوة واحدة لتقييم الوضع من موت الخلايا كلونوجينيك الإشعاع بالفحص المجهري Fluorescence
Summary
البحوث المتعلقة بالإشعاعات المؤينة (الأشعة تحت الحمراء)-موت الخلية كلونوجينيك المستحث مهم لفهم آثار الأشعة تحت الحمراء على الأورام الخبيثة وأنسجة طبيعية. وهنا يصف لنا مقايسة خطوة واحدة لتقييم طرق رئيسية من موت الخلايا المستحثة بالأشعة تحت الحمراء كلونوجينيك استناداً إلى مورفولوجيا 4 ‘, 6-دياميدينو-2-فينيليندولي هيدروكلوريد (DAPI)-الملون الأنوية تصور بالفحص المجهري الأسفار.
Abstract
البحوث المتعلقة بالإشعاعات المؤينة (الأشعة تحت الحمراء)-موت الخلية كلونوجينيك المستحث مهم لفهم تأثير الأشعة تحت الحمراء على الأورام الخبيثة وأنسجة طبيعية. هنا، نحن تصف مقايسة خطوة واحدة سريعة وفعالة من حيث التكلفة لتقييم طرق رئيسية من موت الخلايا كلونوجينيك الناجم عن الأشعة تحت الحمراء، و أي، والمبرمج، وكارثة الانقسامية، والشيخوخة الخلوية في وقت واحد. في هذا الأسلوب، الخلايا التي نمت في كشف غطاء المشع بالأشعة السينية والملون مع 4 ‘, 6-دياميدينو-2-فينيليندولي هيدروكلوريد (DAPI). باستخدام مجهر الأسفار، المبرمج وكارثة الانقسامية والشيخوخة الخلوية هي حددت استناداً إلى مورفولوجيس مميزة من الأنوية الملون DAPI. [ابوبتوسس] تتحدد بوجود هيئات أبوبتوتيك (أي، نوى مكثف ومجزأة). كارثة الانقسامية يتحدد بوجود نوى أن يحمل اثنان أو أكثر من فصوص متميزة ونويات. الشيخوخة الخلوية يتحدد بوجود المرتبطة بالشيخوخة heterochromatic البؤر (أيالحمض النووي تحتوي على البؤر مشرقة وكثافة 30-50). ويسمح هذا النهج المجرب الشاشة بسهولة للخلية كلونوجينيك الموت طرق استخدام مختلف خطوط الخلايا واعدادات معالجة النقاط الزمنية، بهدف توضيح آليات موت الخلية في الخلايا المستهدفة والشروط لمصلحة.
Introduction
الإشعاع المؤين (الأشعة تحت الحمراء) الحث على وسائط متعددة من موت الخلايا كلونوجينيك. البحث عن موت الخلايا المستحثة بالأشعة تحت الحمراء كلونوجينيك مهم لفهم سمية الأشعة تحت الحمراء للأنسجة الطبيعية، فضلا عن وضع أساليب لزيادة فعالية العلاج من السرطان العلاج الإشعاعي. المبرمج وكارثة الانقسامية والشيخوخة الخلوية هي وسائط رئيسية من موت الخلايا كلونوجينيك الناجمة عن الأشعة تحت الحمراء1. المبرمج هو وضع تنظيم لموت الخلايا التي يتم تهيئتها بواسطة الحمض النووي الضرر1. كارثة الانقسامية هو موت الخلايا التي تحدث بسبب الانقسام الشاذة الناجمة عن فواصل مزدوجة-حبلا الحمض النووي التي لم يتم إصلاحها1. يتم تعريف الشيخوخة الخلوية كدولة في الخلية لا رجعة فيه النمو اعتقال2؛ ملاحظة أن الشيخوخة الخلوية لا موت الخلية في حد ذاتها، بل أنها طريقة لموت الخلايا كلونوجينيك لأنه يلغي بقاء الخلية مسن كلونوجينيك.
قد وضعت مختلف الاختبارات المستندة إلى الخلية تقييم فردي المبرمج وكارثة الانقسامية والشيخوخة الخلوية. يمكن تقييم المبرمج بالمحطة الطرفية ديوكسينوكليوتيديل ترانسفيراز dUTP نك-نهاية وضع العلامات (TUNEL) تلطيخ وتلطيخ V أنيكسين، فحوصات الحمض النووي التشرذم و sub-G1 دورة الخلية مرحلة التصميم من خلال التدفق الخلوي1. يمكن تقييم الكارثة الانقسامية التي الفلورة تلطيخ لعلامات الانقسامية، بما في ذلك MPM2، TUNEL تلطيخ والمجهر الإلكتروني1. ويمكن تقييم الشيخوخة الخلوية تلطيخ المرتبطة بالشيخوخة β-جالاكتوسيداسي (SA-β-غال) وفحوصات النمو-الاعتقال والمجهر الإلكتروني1. الأهم من ذلك، يختلف الوضع المهيمن لموت الخلايا كلونوجينيك بين خطوط الخلايا ومعالجة إعدادات3،4. ولذلك، توضيح الشخصية عموما من موت الخلايا كلونوجينيك للحصول على إعداد تجريبي معين، فحوصات متعددة تغطي جميع هذه الأنماط من الموت يجب أن تجري معا، وهي كثيفة العمالة والتكلفة.
في هذه المقالة، يصف لنا تحليل خطوة واحدة سريعة وفعالة من حيث التكلفة في نفس الوقت تقييم المبرمج وكارثة الانقسامية والشيخوخة الخلوية الناجمة عن الأشعة تحت الحمراء3،4. في هذا الأسلوب، الخلايا التي نمت في كشف غطاء المشع بالأشعة السينية والملون مع 4 ‘, 6-دياميدينو-2-فينيليندولي هيدروكلوريد (DAPI). باستخدام مجهر الأسفار، المبرمج كارثة الانقسامية الشيخوخة الخلوية هي كل التعرف على، واستنادا إلى مورفولوجيس المميزة الخاصة بكل منها من الأنوية الملون DAPI. وهذا النهج سيكون مفيداً للتطبيقات بما في ذلك الكشف عن ملامح موت الخلية كلونوجينيك في مختلف خطوط الخلايا وإعدادات معالجة النقاط الزمنية، بهدف التحقيق في آليات موت الخلية في الخلايا المستهدفة وشروط الفائدة.
Protocol
Representative Results
Discussion
فيما يلي الخطوات الحاسمة ضمن البروتوكول. أولاً، الخلايا ينبغي زراعتها على الطبق الثقافة كأحادي الطبقة لإجراء تقييم الخصائص مورفولوجية لنوى DAPI الملون من الصعب لخلايا متعددة الطبقات. تحقيقا لهذه الغاية، في خطوة 2.9، يوصي بنقل دقيق للطبق الثقافة إلى حاضنة؛ اهتزاز للطبق الثقافة يولد دوامة خلايا مع وقف التنفيذ الذي يؤدي إلى تركيز الخلايا في مركز الطبق الثقافة. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي تجنب أوفيركونفلوينسي مما يؤدي إلى خلايا متعددة الطبقات. تحقيقا لهذه الغاية، في خطوة 2.7، يمكن تعديل عدد الخلايا المصنفة في الطبق ثقافة تستند إلى السكان مضاعفة الوقت والفاصل الزمني بين الإشعاع والتثبيت. ويوصي بالجمع بين ما يقرب من 80 في وقت التثبيت. ثانيا، المهم السرعة في التثبيت وتلطيخ DAPI (أي، الخطوات 4 و 5). عدم تناسق بين عينة فيما يتعلق بالوقت الذي تستغرقه هذه الخطوات يمكن أن يؤدي إلى عدم التجانس في كثافة إشارة DAPI في الأنوية، الذي من شأنه أن يحجب تقييم الخصائص المورفولوجية.
في الخطوة 2، 2، يمكن زيادة عدد كشوف الغطاء في صحن ثقافة واحدة؛ يمكن وضعها كحد أقصى أربعة تغطية كشوف في طبق 35 ملم، ويمكن زيادة العدد زيادة استخدام الأطباق أكبر. وضع كشوف تغطية متعددة في كل طبق الثقافة يتيح التشغيل الكفء للوقت بالطبع تقييم معاملة معينة (أي، غطاء يمكن جمعها بكشوف من طبق ثقافة واحدة تلو الأخرى في نقاط زمنية متعددة للفائدة).
في الخطوة 3، 2، يمكن تعديل جرعة الإشعاع وفقا للاهتمام الباحثين. تطبيق جرعة تتفق على خطوط خلايا متعددة تمكن المقارنة بين حساسية لوضع كل من موت الخلايا كلونوجينيك بين خطوط الخلايا. من ناحية أخرى، يمكن استخدام جرعات بقاء iso-كلونوجينيك لكل خط الخلية مقارنة كلونوجينيك خلية الموت التشكيلات الجانبية بين خطوط الخلايا. يمكن تحديد الجرعة بقاء إيزو–كلونوجينيك بواسطة مقايسة البقاء على قيد الحياة كلونوجينيك12. القيمة10 د، الجرعة التي توفر 10% كلونوجينيك البقاء على قيد الحياة، نقطة مشتركة للجرعة بقاء iso-كلونوجينيك.
في الخطوة 3، 3، يمكن تعديل الوقت من الإشعاع للتثبيت وفقا للفائدة الباحثين؛ هذا مهم لأن فترة الذروة للمبرمج المستحثة بالأشعة تحت الحمراء، وكارثة الانقسامية، والشيخوخة الخلوية تختلف وفقا لخط الخلية والعلاج. في هذه المقالة، استخدمنا ح 72 بعد التشعيع كالنقطة الزمنية التي ستكون أكثر فائدة للفحص الأولى ملامح الموت الخلية كلونوجينيك، واستنادا إلى دراسات متعددة من مجموعتنا ووصف آخرون كما يلي21،، 3 , 4 , 8 , 9: (ط) المبرمج الناجمة عن أشعة X في خلايا المنشأ من الأورام الصلبة معظمها يحدث بضعة أيام بعد التشعيع. (ثانيا) X-أشعة الناجمة عن كارثة الانقسامية في الخلايا السرطانية يحدث أبرزها في الثانية أو الثالثة والانقسام بعد الإفراج عنهم من إلقاء القبض على دورة الخلية المؤقتة الناجمة عن الإشعاع. عادة ما يحدث الإفراج عن حوالي 24 ساعة بعد التشعيع، يتبع من ميتوسيس المتكررة على فترات من حوالي 24 حاء (ثالثا) إكس-رأي – الناجمة عن الشيخوخة الخلوية يصبح واضحا بعد فاصل زمني يتوقف على خط الخلية في السؤال: بعد يومين تشعيع لبعض الحالات المبكرة، و 7 أيام بعد التشعيع لمعظم خطوط الخلايا. بعد الحصول على صورة شاملة للخلية كلونوجينيك ملامح الموت من الفحص الأولى، وقت التجارب بالطبع سوف توفر توضيح أكثر تفصيلاً من وقت الذروة لوضع كل من موت الخلايا كلونوجينيك في خط الخلية المحددة و/أو شرط 4من الفائدة.
تجدر الإشارة إلى أن DAPI تلطيخ المقايسة ومقايسة البقاء على قيد الحياة كلونوجينيك، أسلوب معيار الذهبي لتقييم حساسية الإشعاعات، ليست قابلة للتبديل. كارثة الانقسامية والمبرمج فقط تستمر لساعات. وهكذا، يكشف DAPI تلطيخ المقايسة لنقطة زمنية معينة المبرمج وكارثة الانقسامية التي تحدث عند نقطة وقت التقييم. من ناحية أخرى، نتائج بقاء كلونوجينيك الاعتداء في وقت معين نقطة تشمل المبلغ الإجمالي للمبرمج وكارثة الانقسامية التي وقعت خلال فترة الحضانة عادة 10-14 يوما بعد التشعيع. تبقى مختلفة من المبرمج وكارثة الانقسامية، وخلايا مسن على الطبق الثقافة؛ أنها تتراكم تدريجيا مع مرور الوقت وبعد التشعيع. ولذلك، تعكس النتائج على حد سواء DAPI تلطيخ المقايسة ومقايسة البقاء على قيد الحياة كلونوجينيك المبلغ الإجمالي للشيخوخة التي حدثت أثناء فترة الحضانة. الأهم من ذلك، تتفاوت نسبة المبرمج وكارثة الانقسامية والشيخوخة الناجمة عن الإشعاع على نطاق واسع وفقا للخلية خط وتشعيع الجرعات. أخذت معا، نظرياً، نتائج تحليل واحد لا يمكن ترجمتها مباشرة إلى تلك مقايسة الأخرى.
وقد DAPI تلطيخ المقايسة عدد قليل من القيود. أولاً، أنه لا يزال المثير للجدل عما إذا كانت الكارثة الانقسامية طريقة متميزة لموت الخلايا. في ميدان البيولوجيا الإشعاعية، يعتبر كارثة الانقسامية وسيلة رئيسية لموت الخلايا المستحثة بالأشعة تحت الحمراء التي تختلف عن آليات أخرى ل موت الخلية كلونوجينيك1. من ناحية أخرى، يجادل آخرون بأن كارثة الانقسامية ليست طريقة متميزة لموت الخلية ولكن بدلاً من ذلك عملية التي تسبق موت الخلايا المبرمج ونخر13،14منها. وهكذا، المبرمج وكارثة الانقسامية قد تتداخل إلى حد ما. الدراسات السابقة، والثانية تشير إلى أن الشيخوخة الخلوية يمكن أن تحدث في غياب صاف في بعض خطوط الخلايا ومعالجة إعدادات2. في فحوصات الحالية، وأخرى مصممة خصيصا لكل خلية كلونوجينيك يجب استخدام وضع الموت لزيادة متانة الاستنتاجات التي خلصت إليها تجربة معينة. ثالثا، لا يمكن تقييم DAPI تلطيخ مقايسة وسائط موت الخلايا كلونوجينيك خلاف المبرمج وكارثة الانقسامية والشيخوخة الخلوية (مثلنخر وأوتوفاجي)،. رابعا، قد لا تم توضيح فائدة DAPI تلطيخ المقايسة مؤشرا لاستجابة الورم للعلاج الإشعاعي في العيادة. من وجهة النظر هذه، مقايسة البقاء على قيد الحياة كلونوجينيك، الذي يقيم المبلغ الإجمالي لموت الخلية كلونوجينيك، متفوقة على DAPI تلطيخ المقايسة لأنه تم إنشاء ارتباط بين SF2، الكسر الباقين على قيد الحياة من خلايا المشع مع 2 غراي الأشعة السينية، واستجابة الورم للعلاج الإشعاعي15. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن مقايسة البقاء على قيد الحياة كلونوجينيك لا يستخدم على نطاق واسع في العيادة، أساسا بسبب الحاجة إلى درجة عالية من الخبرة وفترة طويلة من الزمن (أي14 يوما) للحصول على البيانات. وعلى سبيل المقارنة، إجراءات DAPI تلطيخ المقايسة أبسط وتستغرق وقتاً أقل، حوالي 3-4 أيام، إلى حد كبير لتوليد نتائج. الأداة المساعدة لتلطيخ DAPIوسيتم اختبار المقايسة مؤشرا لاستجابة الورم للعلاج بالأشعة في العيادة في المستقبل القريب.
وخلاصة القول، DAPI تلطيخ مقايسة مقايسة خطوة واحدة فعالة من حيث التكلفة لتقييم ثلاثة أنماط رئيسية من موت الخلايا كلونوجينيك المستحثة بالأشعة تحت الحمراء في نفس الوقت. ويسمح هذا النهج واحدة الشاشة بسهولة مع أوضاع من موت الخلايا كلونوجينيك لمختلف خطوط الخلايا وإعدادات معالجة النقاط الزمنية، بهدف توضيح آليات موت الخلية في الخلايا المستهدفة والشروط للفائدة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر السيدة أكيكو شيباتا للمساعدة التقنية. وأيد هذا العمل بمعونة من وزارة التربية والتعليم، والثقافة والرياضة، والعلوم والتكنولوجيا في اليابان عن برامج للمدارس الرائدة في الدراسات العليا، وزراعة قادة العالم في المداواة أيون الثقيلة والهندسة.
Materials
| cover slip | Matsunami | C013001 | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | |
| sucrose | Sigma-Aldrich | 84097-250G | |
| phosphate-buffered saline | Cosmo Bio | 16232000 | |
| scalpel | Kai Medical | No.20, 520-A | |
| 35 mm cell culture dish | Falcon | 353001 | |
| trypsin | Wako | 201-16945 | |
| inverted phase microscope | Shimazu | 114-909 | |
| X-ray irradiator | Faxitron Bioptics | Faxitron RX-650 | |
| square culture dish | Corning | 431110 | |
| slide glass | Matsunami | Pro-11 | |
| DAPI staining reagent | Cell Signaling | 8961S | |
| fluorescence microscope | Nikon | ECLIPSE Ni | |
| fluorescence microscope DAPI filter | Nikon | U-FUW, BP340-390, BA420IF, DM410 | |
| fluorescence microscope lens (20×) | Nikon | Plan Apo λ 20X/0.75 | |
| fluorescence microscope lens (60×, oil) | Nikon | Plan Apo λ 60X/1.40 oil | |
| oil | Olympus | N5218600 | |
| CCD camera | Nikon | DS-Qi2 | |
| digital image acquisition software | Nikon | NIS-Elements Document | |
| lens cleaner | Olympus | OT0552 | |
| chloroform | Wako | 035-02616 |
References
- Wouters, B. G., Joiner, M. C., van der Kogel, A. J. Cell death after irradiation: how, when and why cells die. Basic Clinical Radiobiology. 4th ed. , 27-40 (2009).
- Aird, K. M., Zhang, R. Detection of senescence-associated heterochromatin foci (SAHF). Methods Mol. Biol. 965, 185-196 (2013).
- Kobayashi, D., et al. Mitotic catastrophe is a putative mechanism underlying the weak correlation between sensitivity to carbon ions and cisplatin. Sci. Rep. 7, 40588 (2017).
- Amornwichet, N., et al. Carbon-ion beam irradiation kills X-ray-resistant p53-null cancer cells by inducing mitotic catastrophe. PLoS One. , 115121 (2014).
- Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nat. Protoc. 2, 2276-2284 (2007).
- Sawai, Y., et al. Effectiveness of sulforaphane as a radiosensitizer for murine osteosarcoma cells. Oncol. Rep. 29, 941-945 (2013).
- Cummings, B. S., Wills, L. P., Schnellmann, R. G. Measurement of cell death in mammalian cells. Curr. Protoc. Pharmacol. , (2012).
- Oike, T., et al. C646, a selective small molecule inhibitor of histone acetyltransferase p300, radiosensitizes lung cancer cells by enhancing mitotic catastrophe. Radiother. Oncol. 111, 222-227 (2014).
- Oike, T., et al. A synthetic lethality-based strategy to treat cancers harboring a genetic deficiency in the chromatin remodeling factor BRG1. Cancer Res. 73, 5508-5518 (2013).
- Russo, A. L., et al. In vitro and in vivo radiosensitization of glioblastoma cells by the poly (ADP-ribose) polymerase inhibitor E7016. Clin. Cancer Res. 15, 607-612 (2009).
- Di Micco, R., et al. Interplay between oncogene-induced DNA damage response and heterochromatin in senescence and cancer. Nat. Cell Biol. 13, 292-302 (2011).
- Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nat. Protoc. 1, 2315-2319 (2006).
- Vakifahmetoglu, H., Olsson, M., Zhivotovsky, B. Death through a tragedy: mitotic catastrophe. Cell Death Differ. 15, 1153-1162 (2008).
- Imreh, G., Norberg, H. V., Imreh, S., Zhivotovsky, B. Chromosomal breaks during mitotic catastrophe trigger γH2AX-ATM-p53-mediated apoptosis. J. Cell Sci. 129, 1950 (2016).
- Torres-Roca, J. F. A molecular assay of tumor radiosensitivity: a roadmap towards biology-based personalized radiation therapy. Per. Med. 9, 547-557 (2012).
