Bioquímico celular-free fluorométrica ensaio enzimático para medição do elevado-throughput de peroxidação lipídica em lipoproteína de alta densidade

Doença cardiovascular aterosclerótica (DCV) é a principal causa de morte em todo o mundo^1,2. Estudos epidemiológicos têm demonstrado que baixos níveis de lipoproteína de alta densidade (HDL) colesterol geralmente estão inversamente associados com o risco para o desenvolvimento da aterosclerose^1,2. Embora diversos estudos apoiam um papel atheroprotective para HDL^1,2, o mecanismo pelo qual o HDL atenua o início e progressão da aterosclerose é complexo ^3,4. Assim, tem sido sugerido que a complexa estrutura e função do HDL, ao invés de nível absoluto podem prever com mais precisão aterosclerose ^5,6,7,8. Ocorrem vários HDL proteínas e lipídios composicionais alterações que prejudicam a função do HDL em Estados inflamatórios como a aterosclerose. Estes i) reduzir seu potencial de efluxo de colesterol ⁹, ii) diminuir anti-inflamatório e aumento de HDL-associado a proteínas pró-inflamatórias ^6,7, iii) diminuição fator os níveis de antioxidantes e atividade e HDLs capacidade de inibir a oxidação da lipoproteína de baixa densidade (LDLox)¹⁰ e iv) aumentar lipídico hidroperóxido conteúdo e redox atividade (HDLox)^9,11. Robustos ensaios que avaliam as funções de pleotropic de HDL (tais como o efluxo de colesterol, função antioxidante) podem complementar a determinação de HDL-HDL-C, na clínica.

Função do HDL é geralmente avaliada por métodos baseados em células, tais como o colesterol efluxo ensaio^8,12,13,14. Esses métodos têm limitações principais incluindo heterogeneidade significativa em relação a tipos de células utilizadas, tipo de leitura relatado, a falta de padronização e confundimento efeitos de triglicerídeos ^7,15. Estas desvantagens apresentam dificuldades para grandes estudos clínicos¹⁶. Ensaios sem célula podem dar mais eficázes de função de HDL em comparação com ensaios cell-based. O efluxo de colesterol é uma das mais importantes funções de HDL, mas isso só pode ser determinado por ensaios cell-based. Outras abordagens para determinar a função do HDL como proteomics^{17,18,19,20,21,22,23, 24} e ensaios de quimiotaxia de monócitos baseada em célula de HDL função ^17,22,25 não tem sido padronizados e não pode ser usados em estudos humanos em grande escala.

HDL tem antioxidante significativa atheroprotective efeito^5,6,7,8. Determinou-se a função antioxidante de HDL na presença de LDL anterior célula livre ensaios fluorométrica ²⁶. Estes métodos bioquímicos fluorométrica de função antioxidante de HDL foram originalmente desenvolvidos por Mohamad Navab e Alan Fogelman e seus colegas²⁶. Embora muitos estudos humanos usaram estes métodos para determinar o HDL função ^{17,18,19,20,21,22,23 ,24}, lipídios (HDL)-lipídeos (LDL) e interações lipid-fluorocromo podem limitar a reprodutibilidade destes celular grátis não enzimáticos bioquímicos ensaios de HDL função^27,28.

Recente interesse centrou-se sobre as consequências funcionais da oxidação de HDL que é o resultado da oxidação de lipídios e proteínas dentro de HDL ^27,29,30. Estudos prévios mostraram que oxidação de HDL prejudica HDL função ^27,29,30. HDL tem um papel importante no transporte de peróxidos lipídicos e alta quantidade de peróxidos lipídicos está relacionada com função anormal do HDL. Assim, teor de peróxido lipídico HDL pode ser usado para determinar o HDL função ^9,17,20,31 e dada as limitações conhecidas dos ensaios prévios de HDL função^7, de^27,de ^15,32, desenvolvemos um método alternativo de fluorométrica que quantifica o HDL lipid índice de peróxido (HDLox) ³². Este método baseia-se a enzima peroxidase de rábano (HRP) e o fluorocromo vermelho Amplex que pode quantificar (sem oxidase de colesterol), o teor de peróxido lipídico por mg de HDL-C ³². O princípio bioquímico do ensaio é mostrado na Figura 1. Mostramos que essa abordagem baseada em fluorescência não tem as limitações de prévia HDL função ensaios^27,28. Este ensaio tem sido ainda mais refinado e padronizado em nosso laboratório para que confiável pode ser usada em estudos humanos em grande escala, mesmo com criopreservado plasma ^{32,33,34, 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42}. a leitura deste teste é associada com leituras de ensaios cell-based validados, medidas de substituto de doenças cardiovasculares, inflamação sistêmica, disfunção imune e risco cardiovascular e metabólico associado fenótipos ^{32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39}. aqui, descrevemos este método simples, porém robusto para medir o teor de peróxido do lipídico HDL (HDLox). Este ensaio pode ser usado como uma ferramenta para responder perguntas de pesquisas importantes sobre o papel da função de HDL em doenças humanas onde a inflamação sistêmica, estresse oxidativo e lipídios oxidados têm um papel-chave (tais como aterosclerose)³².