Kornea doku Mühendisliği: İnsan kornea sinir Stromal etkileşimlerin bir Vitro modeli
Summary
Bu iletişim kuralı muayene ve etkileşimleri iki hücre tiplerinin anlayış yardımcı olmak için nerede kornea stromal hücreler ve farklılaştırılmış nöronal hücre birlikte kültürlü bir roman üç boyutlu vitro modeli, açıklar.
Abstract
Doku Mühendisliği ile yaklaşık 10 milyon kişi kornea vizyon kaybı1ile acı dünya çapında insan kornea replasmanları için yüksek talep nedeniyle önemli tanıma kazanmıştır. Uygun insan kornealar, üç boyutlu (3D) doku içinde önemli bir ilerleme için talep adrese Mühendisliği2,3,4yapılmıştır. Bu kornea modelleri arasında değişir basit monolayer sistemleri çok katmanlı modelleri, 3D tam-kalınlık kornea eşdeğerleri2‘ ye lider.
Ancak, çok katmanlı 3D kornea dokusu yapı, fonksiyon ve farklı hücre türleri (örneğin, sinir, ağ için tarihi yoksun benzerlik için bir 3D doku Mühendisliği kornea vitro hastalık modelleri bağlamında kullanımı eğitimi epitel, stroma ve endotel)2,3. Buna ek olarak, talep vitro kornea dokusu modelleri için bir girişim için eczacılık ürünleri hayvan test azaltmak için artmıştır. Böylece, daha gelişmiş modeller daha iyi sistemleri insan fizyolojik gereksinimleri için maç için gerekli olan ve daha çok hasta popülasyona ilgili bir model geliştirilmesi kesinlikle gereklidir. Birden fazla hücre türü kornea hastalıkları ve dystrophies, Keratokonus, diyabetik Keratopathy ve Fuchs, gibi etkilenir verilen bu birincil insan kornea fibroblastlar (HCFs) sağlıklı bağış ve neurons 3D ortak kültür modeli bu modeli içerir SH-SY5Y hücre satırı. Bu bizim için ilk kez insan kornea dokusu içinde iki hücre tipleri arasındaki etkileşimler araştırmak için izin verir. Biz bu model potansiyel sinir hasar oluşturan kornea hastalıkları sinir stromal etkileşimleri ile ilgili temel mekanizmaları incelemek inanıyoruz. Bu 3D model kornea dokusu içinde vivo temel anatomik ve fizyolojik doğasını yansıtır ve gelecekte kornea kusurları araştıran yanı sıra çeşitli ajanların etkinliği hayvan test etmeden önce eleme için bir araç olarak kullanılabilir.
Introduction
İnsan vücudunda kornea en yoğun innervated dokudur. Sinirleri dokunma, ağrı, sıcaklık gibi çeşitli duyumlar sorumludur ve iyileşmesi, refleksleri yanıp, gözyaşı üretim ve salgı5,6,7önemli bir rol olarak da mevcuttur. Kornea, stromal sinir mayo limbal pleksus ortaya ve periferik Korneal stroma Radyal girin. Stromal sinir organizasyonu için kollajen lamellae paralel ve daha fazla içine doğru yüzeysel stroma5,8devam ederken daha küçük fascicles şube. Sinir lifleri daha da epitel tabakası nüfuz ve böylece, innervasyon yaygın olarak kornea epitel ve stroma üzerinden dışarı yayılır. Bu nedenle, innervasyon kornea sağlıklı ve hastalıklı durumda önemli bir rol vardır. Bu protokol için in vivo sinir stromal etkileşimleri taklit etmek için kendi türünde ilk roman 3D vitro manken ilerlemesi ortaya koyuyor. Nöronal büyüme çalışırdım en köklü, iyi karakterize satırlardan birini olduğu gibi SH-SY5Y hücre kültürünü bu çalışma için kullanıldı. SH-SY5Y hücre kültürünü her iki substrat yapışık (S-type) üretmek için tanımlanmıştır ve neuroblastic (N-tipi) hücreleri transdifferentiation9tabi olabilir. Sonuç olarak, bu hücre kültürünü N-tipi hücre Çift Kişilik birbirini izleyen subclone seçimden türetilmiştir olsa bile, ayrıca S-type hücrelerin nöronlar aracılığıyla retinoik asit ve beyin kaynaklı içine farklılaşma geçiren küçük bir dizi içerir Nörotrofik faktör9. Bu kornea komplikasyon diabetik retinopati (DM) ve diğer göz hastalıkları ile ilgili daha iyi bir anlayış neden olabilir bir araç sağlar. Alma ve oküler hastalığı olan hastalarda neurons kültür ile ilgili nedenlerden dolayı nöronal etkileşimleri eğitim ve Korneal stroma ile sinyal önemli etkileri bu 3D vitro modeli sağlar.
Hastalıklı koşulları kez güvenliği aşılan bir yaşam kalitesi için önde gelen bir çok büyük ölçekli, vücudun çeşitli dokuları etkiler. Oküler dystrophies ortak komplikasyonlar genellikle sistemik hastalıklar ve kurşun görme keskinliği kaybı veya hatta kalıcı görme kaybı ile ilişkili vardır. Kapsamlı çalışmalar çoğu kez daha iyi hastalık durumu gibi Bazal hücresel düzeyde etkilerini anlamak için gerekli. Gibi hastalıklar etkileri çalışmaya, doku mühendisliği uygulamaları yardımıyla çeşitli in vivo ve in vitro modelleri geliştirilmiştir. Kornea doku mühendisliği uygulamaları bilim10,11,12,13,14çeşitli alanlarda büyük ilgi topladı var ama sırasında hala önemli sınırlamaları vardır fiili uygulama, kornea dahil greft reddi, enfeksiyonlar ve skarlasma10,11,12,13,14. Başarılı bir şekilde geliştirilen ve çeşitli vitro modelleri3,15,16,17,18, kurulan birçok çalışma vardır 19,20,21,22,23,24,25,26. 3D vitro en umut verici ve büyük bilimsel ilgi modeller. 3D modelleri daha iyi fibrozis sırasında kritik olan ve şifa15,27,28,29yara vivo içinde hücresel ve fizyolojik olaylar ayna olduğu bilinmektedir. Bu vitro modelleri kornea komplikasyonlar da dahil olmak üzere farklı hastalık tedavi için yeni tedavi yaklaşımları bulma konusunda önemli bir rol oynamak. İnnervasyon kornea işlevlerinde önemli rol rağmen küçük bir çaba periferik sinirleri yayılması kornea dokusu mühendislik yapıları2,3içinde tanıtmak için yapılmıştır. Ancak, önerilen 3D vitro hücre yapıları istenen doku işlevselliği elde etmek için hedef doku taklit.
Diyabetik keratopathy nöronal kusurları nedeniyle burada açıklanan model için bariz bir uygulama olmakla birlikte, Keratokonus ve Fuchs dystrophies de dahil olmak üzere bir insan vitro modelinden yararlanabilir birçok kornea hastalıkları vardır. Bizim 3D modeli bu umudu ortaya çıkar ve vitro gösterilişinin ilaç dağıtım değerlendirmek için kornea dokusunun ve Emanet yeni oküler ilaçların geliştirilmesi öneriyor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Çeşitli çalışmalarda de kornea hastalıkları daha iyi bir anlayış geliştirmelerine yardımcı olarak tedavileri keşfetmek çeşitli hayvan modelleri geliştirilmesi üzerinde duruldu. Ancak, bu çalışmalar insanlar için önemli bir değer doğrulanmadı. Bugüne kadar çeşitli vitro modelleri geliştirilmiş ve onların olağanüstü klinik önemi nedeniyle yaygın olarak araştırıldı. Bizim daha önce kurulan 3D vitro modeli önemli ölçüde vizyon araştırma gelişmeler tıp bilimin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Ben Fowler sayesinde bizim samimi-TEM deneyleri ile onun teknik yardım için genişletmek istiyorum.
Materials
| Healthy corneal tissue | NDRI | Samples from donors with no ocular trauma or systemic disease | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Solution (1X) | Gibco by Life Technologies | 14190-144 | |
| Sterile forceps | Fischer Scientific | 13-812-42 | Fisherbrand Dissecting Extra-Fine-Pointed Splinter Forceps |
| Single edge razor blades | Personna | 270100 | |
| Sterile surgical scalpel blades No.10 | Feather Surgical Blade | 2976#10 | |
| Eagle’s Minimum Essential Medium | ATCC | 30-2003 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 | 10% FBS is required for media preparation |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco by Life Technologies | 15240-062 | 1% Antibiotic-Antimycotic is required for media preparation |
| 0.05% Trypsin EDTA(1X) | Gibco by Life Technologies | 25300062 | |
| Polycarbonate membrane inserts with 0.4-μm pores | Corning Costar | 3412 | |
| 2-O-α-Dglucopyranosyl-L-ascorbic acid (Vitamin C) | Sigma-Aldrich | SMB00390-14 | A concentration of 0.5 mM should be used for the study |
| Wax block | VWR | 50-949-027 | |
| SH-SY5Y Neuroblastoma cells | ATCC | SHSY5YATCC CRL-2266 | |
| Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | SRP3014-10UG | Final concentration of 10uM needs to be used |
| BDNF | Sigma-Aldrich | R2625-100MG | Final concentration of 2nM needs to be used |
| Dimethyl Sulfoxide(DMSO) | VWR-Alfa Aesar | 67-68-5 | Ultra Pure Grade-Sterile DMSO to be used |
| Thermo Scientific Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks (T25) | Fisher Scientific | 12-565-351 | |
| Thermo Scientific Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks (T75) | Fisher Scientific | 12-565-349 |
References
- Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. Br J Ophthalmol. 96 (5), 614-618 (2012).
- Rönkkö, S., Vellonen, K. -. S., Järvinen, K., Toropainen, E., Urtti, A. Human corneal cell culture models for drug toxicity studies. Drug Delivery and Translational Research. 6 (6), 660-675 (2016).
- Ghezzi, C. E., Rnjak-Kovacina, J., Kaplan, D. L. Corneal tissue engineering: recent advances and future perspectives. Tissue Eng Part B Rev. 21 (3), 278-287 (2015).
- Shafaie, S., Hutter, V., Cook, M. T., Brown, M. B., Chau, D. Y. S. In Vitro Cell Models for Ophthalmic Drug Development Applications. BioResearch Open Access. 5 (1), 94-108 (2016).
- Shaheen, B. S., Bakir, M., Jain, S. Corneal nerves in health and disease. Surv Ophthalmol. 59 (3), 263-285 (2014).
- Beuerman, R. W., Schimmelpfennig, B. Sensory denervation of the rabbit cornea affects epithelial properties. Exp Neurol. 69 (1), 196-201 (1980).
- Heigle, T. J., Pflugfelder, S. C. Aqueous tear production in patients with neurotrophic keratitis. Cornea. 15 (2), 135-138 (1996).
- Wang, S., et al. In vitro 3D corneal tissue model with epithelium, stroma, and innervation. Biomaterials. 112, 1-9 (2017).
- Ross, R. A., Spengler, B. A., Biedler, J. L. Coordinate morphological and biochemical interconversion of human neuroblastoma cells. J Natl Cancer Inst. 71 (4), 741-747 (1983).
- Griffith, L. G., Naughton, G. Tissue engineering – Current challenges and expanding opportunities. Science. 295 (5557), (2002).
- Guo, X., et al. Morphologic characterization of organized extracellular matrix deposition by ascorbic acid-stimulated human corneal fibroblasts. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (9), 4050-4060 (2007).
- Karamichos, D. Ocular tissue engineering: current and future directions. J Funct Biomater. 6 (1), 77-80 (2015).
- Karamichos, D., Brown, R. A., Mudera, V. Collagen stiffness regulates cellular contraction and matrix remodeling gene expression. J Biomed Mater Res A. 83 (3), 887-894 (2007).
- Ruberti, J. W., Zieske, J. D. Prelude to corneal tissue engineering – gaining control of collagen organization. Prog Retin Eye Res. 27 (5), 549-577 (2008).
- Karamichos, D., Guo, X. Q., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Human corneal fibrosis: an in vitro model. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (3), 1382-1388 (2010).
- Chen, F. M., Liu, X. Advancing biomaterials of human origin for tissue engineering. Prog Polym Sci. 53, 86-168 (2016).
- Priyadarsini, S., Sarker-Nag, A., Rowsey, T. G., Ma, J. X., Karamichos, D. Establishment of a 3D In Vitro Model to Accelerate the Development of Human Therapies against Corneal Diabetes. PLoS One. 11 (12), e0168845 (2016).
- Karamichos, D., Hjortdal, J. Keratoconus: tissue engineering and biomaterials. J Funct Biomater. 5 (3), 111-134 (2014).
- Wilson, S. L., Yang, Y., El Haj, A. J. Corneal Stromal Cell Plasticity: In Vitro Regulation of Cell Phenotype Through Cell-Cell Interactions in a Three-Dimensional Model. Tissue Engineering Part A. 20 (1-2), 225-238 (2014).
- Proulx, S., et al. Reconstruction of a human cornea by the self-assembly approach of tissue engineering using the three native cell types. Molecular Vision. 16 (234-236), 2192-2201 (2010).
- Gonzalez-Andrades, M., et al. Establishment of a novel in vitro model of stratified epithelial wound healing with barrier function. Sci Rep. 6, 19395 (2016).
- Hopkins, A. M., DeSimone, E., Chwalek, K., Kaplan, D. L. 3D in vitro modeling of the central nervous system. Prog Neurobiol. 125, 1-25 (2015).
- Schulz, S., et al. Natural Corneal Cell-Based Microenvironment as Prerequisite for Balanced 3D Corneal Epithelial Morphogenesis: A Promising Animal Experiment-Abandoning Tool in Ophthalmology. Tissue Engineering Part C-Methods. 20 (4), 297-307 (2014).
- Gao, J., Wang, Y., Zhao, X., Chen, P., Xie, L. MicroRNA-204-5p-Mediated Regulation of SIRT1 Contributes to the Delay of Epithelial Cell Cycle Traversal in Diabetic Corneas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (3), 1493-1504 (2015).
- Koulikovska, M., et al. Enhanced regeneration of corneal tissue via a bioengineered collagen construct implanted by a nondisruptive surgical technique. Tissue Eng Part A. 21 (5-6), 1116-1130 (2015).
- Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Progress in retinal and eye research. 49, 17-45 (2015).
- Zieske, J. D. Extracellular matrix and wound healing. Curr Opin Ophthalmol. 12 (4), 237-241 (2001).
- Karamichos, D., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Transforming growth factor-beta3 regulates assembly of a non-fibrotic matrix in a 3D corneal model. J Tissue Eng Regen Med. 5 (8), e228-e238 (2011).
- Karamichos, D., Lakshman, N., Petroll, W. M. An experimental model for assessing fibroblast migration in 3-D collagen matrices. Cell Motil Cytoskeleton. 66 (1), 1-9 (2009).
- Karamichos, D., et al. Novel in Vitro Model for Keratoconus Disease. J Funct Biomater. 3 (4), 760-775 (2012).
