פרוטוקול זה מתאר את הרומן תלת מימדי במבחנה מודל, שבו תאי סטרומה הקרנית ואת תאים עצביים מתורבתים יחד כדי לסייע בדיקה והבנה של האינטראקציות של תא שני הסוגים.
הנדסת רקמות זכה להכרה משמעותית בשל הביקוש הגבוה החלפת הקרנית האנושית בערך 10 מיליון אנשים ברחבי העולם הסובלים אובדן ראייה הקרנית1. כדי לענות על הביקוש קיימא הקרנית האנושית, התקדמות משמעותית ברקמה תלת מימדי (3D) הנדסה הפך2,3,4. מודלים אלה קרנית נע בין מערכות חד שכבתי פשוטה דגמי מרובה שכבות, שמוביל תלת-ממד מלא-עובי הקרנית ששווי הערך2.
עם זאת, השימוש של הקרנית רקמות מהונדסים 3D בהקשר של במבחנה המחלה מודלים למד עד תאריך חסר דמיון המבנה מרובה שכבות תלת-ממד רקמת הקרנית, פונקציה של הרשתות של סוגי תאים שונים (כלומר, חוצפה, אפיתל stroma, אנדותל)2,3. בנוסף, גדל הביקוש במבחנה מודלים רקמת הקרנית בניסיון להפחית את הניסויים בחיות עבור מוצרים פרמצבטיים. לפיכך, דגמים מתוחכמים יותר נדרשים על מנת שיתאימו יותר מערכות לדרישות הפיזיולוגיות האנושי, הפיתוח של מודל זה יותר רלוונטי האוכלוסייה המטופלת הוא הכרחי. בהתחשב בכך סוגי תאים מרובים הקרנית מושפעים ומחלות dystrophies, כגון קרטוקונוס, Keratopathy סוכרתית, פוקס, מודל זה כולל דגם תלת-ממד תרבות משותפת של ראשי האדם הקרנית fibroblasts (HCFs) תורמים בריא, נוירונים מ הקו תא SH-SY5Y. זה מאפשר לנו לראשונה לחקור את האינטראקציות בין סוגי שני תאים בתוך הרקמה הקרנית האנושית. אנו מאמינים כי מודל זה יכול באופן פוטנציאלי לנתח המנגנונים הבסיסית המשויכת את האינטראקציות סטרומה-עצב של מחלות קרנית כי התערוכה עצב נזקים. דגם תלת-ממד זה מראות הטבע אנטומית, פיזיולוגית בסיסית של ה רקמת הקרנית ויוו , יכול לשמש בעתיד ככלי עבור חוקרים פגמים הקרנית, כמו גם הקרנת את היעילות של סוכנים שונים לפני הניסויים בחיות.
בגוף האדם, הקרנית היא הרקמה innervated ביותר. העצבים אחראים על תחושות שונות כמו מגע, כאב, טמפרטורה, ויש גם תפקיד חיוני ריפוי פצעים, ממצמץ רפלקסים, לקרוע הייצור, ועל הפרשת5,6,7. הקרנית, גזעי עצב סטרומה נובעים מקלעת limbal והזן stroma הקרנית היקפיים בצורה רדיאלית. הארגון עצב סטרומה במקביל lamellae קולגן, הם עוד סניף לתוך קטנות fascicles הם התקדמותך לעבר שטחי משתית5,8. סיבי העצב עוד לחדור את שכבת האפיתל, לפיכך, העצבוב נרחב מתפרסת על פני אפיתל הקרנית משתית. לכן, העצבוב יש תפקיד חיוני במדינת בריאים וחולים של הקרנית. ב פרוטוקול זה, אנו חושפים את ההתקדמות של הרומן 3D במבחנה דוגמן, הוא הראשון מסוגו כדי לחקות את האינטראקציות סטרומה-עצב ויוו . שורת התאים SH-SY5Y נעשה שימוש במחקר זה, כי הוא אחד הקווים הוותיקים ביותר, טוב מאופיין המשמשות ללימוד צמיחה עצביים. שורת התאים SH-SY5Y כבר מתואר לייצר שני מחסידי המצע (S-type), neuroblastic (מסוג N) תאים זה יכול לעבור transdifferentiation9. כתוצאה מכך, אף-על-פי קו תא זה נגזר מתוך מבחר טריפל subclone רצופות של תאים מסוג N, הוא מכיל גם מספר קטן של S-type תאים שעברו התמיינות לתוך הנוירונים באמצעות retinoic חומצה, נגזר המוח neurotrophic פקטור9. זה מספק כלי זה עשוי להוביל להבנה טובה יותר של הקרנית הסיבוכים עם רטינופתיה סוכרתית (DM) ומחלות אחרות עינית. בשל הקשיים הקשורים בהשגת culturing נוירונים של חולים עם מחלה עינית, מודל זה 3D במבחנה מספק השלכות משמעותית הלומדים את האינטראקציות עצביים, איתות עם stroma הקרנית.
תנאים חולה לעיתים קרובות משפיעים על רקמות שונות בגוף בקנה מידה גדול מאוד, המוביל אל איכות חיים בסכנה. Dystrophies עינית סיבוכים נפוצים קשורה לעיתים קרובות עם מחלות מערכתיות ולהוביל אובדן של חדות הראייה או אובדן ראייה ואפילו קבע. מחקרים מקיפים חיוניים לעתים קרובות לצורך הבנה טובה יותר של מצב המחלה, כמו גם את ההשפעות ברמה התאית הבזליים. לחקור את ההשפעות של מחלות כאלה, פותחו מודלים שונים ב- vivo ו- in vitro לקשרי עם העזרה של רקמות יישומי הנדסה. יישומי הנדסת רקמות הקרנית משכו עניין רב ברחבי בתחומים השונים של מדעי10,11,12,13,14, אך ישנן מגבלות הגדולות עדיין במהלך יישום בפועל, לרבות הקרנית להשתיל דחיות, דלקות וצלקות10,11,12,13,14. ישנם מספר מחקרים יש בהצלחה פיתח והקים שונים במבחנה מודלים3,15,16,17,18, 19,20,21,22,23,24,25,26. דגמי תלת-ממד במבחנה הם המבטיחים ביותר עניין מדעי רב. דגמי תלת-ממד ידועים יותר לשקף ויוו הסלולר האירועים ופיזיולוגיים הן קריטיות במהלך פיברוזיס, פצע ריפוי15,27,28,29. מודלים אלה במבחנה לשחק תפקיד חשוב למצוא גישות טיפוליות חדשות לטיפול במצבים למחלות שונות כולל סיבוכים הקרנית. למרות תפקיד קריטי של העצבוב בפונקציות הקרנית, הפך מעט מאמץ כדי לקדם את הפצת במערכת העצבים ההיקפית בתוך הקרנית בונה רקמות מהונדסים2,3. עם זאת, המבנה תא המוצע 3D במבחנה לחקות את רקמת המטרה כדי להשיג את הפונקציונליות הרקמה הרצויה.
בעוד keratopathy סוכרתית הוא יישום ברור עבור המודל המתואר כאן בשל הליקויים עצביים, ישנן מספר מחלות הקרנית אחרות יכולים להפיק תועלת מודל אנושי במבחנה כולל dystrophies קרטוקונוס, פוקס. דגם התלת-ממד שלנו מגיח זה פרוספקט, מציע הפיתוח של ייצוג במבחנה של רקמת הקרנית כדי להעריך תרופות והבטיחות של תרופות חדשות עינית.
מספר מחקרים התמקדו על פיתוח מודלים בבעלי חיים שונים יכולים לעזור לפתח הבנה טובה יותר של מחלות הקרנית וכן לגלות טיפולים. עם זאת, ערך משמעותי לבני ממחקרים אלה לא אומת. עד כה, מודלים שונים במבחנה יש כבר שפותחו ונחקרו נרחב עקב שלהם משמעות קלינית יוצא מן הכלל. המודל שלנו שנקבעו קודם 3D במבח…
The authors have nothing to disclose.
ברצוננו להרחיב שלנו כנה בזכות ד ר בן פאולר לעזרה טכנית שלו עם הניסויים TEM.
Healthy corneal tissue | NDRI | Samples from donors with no ocular trauma or systemic disease | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Solution (1X) | Gibco by Life Technologies | 14190-144 | |
Sterile forceps | Fischer Scientific | 13-812-42 | Fisherbrand Dissecting Extra-Fine-Pointed Splinter Forceps |
Single edge razor blades | Personna | 270100 | |
Sterile surgical scalpel blades No.10 | Feather Surgical Blade | 2976#10 | |
Eagle’s Minimum Essential Medium | ATCC | 30-2003 | |
Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 | 10% FBS is required for media preparation |
Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco by Life Technologies | 15240-062 | 1% Antibiotic-Antimycotic is required for media preparation |
0.05% Trypsin EDTA(1X) | Gibco by Life Technologies | 25300062 | |
Polycarbonate membrane inserts with 0.4-μm pores | Corning Costar | 3412 | |
2-O-α-Dglucopyranosyl-L-ascorbic acid (Vitamin C) | Sigma-Aldrich | SMB00390-14 | A concentration of 0.5 mM should be used for the study |
Wax block | VWR | 50-949-027 | |
SH-SY5Y Neuroblastoma cells | ATCC | SHSY5YATCC CRL-2266 | |
Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | SRP3014-10UG | Final concentration of 10uM needs to be used |
BDNF | Sigma-Aldrich | R2625-100MG | Final concentration of 2nM needs to be used |
Dimethyl Sulfoxide(DMSO) | VWR-Alfa Aesar | 67-68-5 | Ultra Pure Grade-Sterile DMSO to be used |
Thermo Scientific Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks (T25) | Fisher Scientific | 12-565-351 | |
Thermo Scientific Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks (T75) | Fisher Scientific | 12-565-349 |