Hoornvlies weefselengineering: Een In Vitro Model van de interacties die stromale-zenuwen van het hoornvlies, menselijke
Summary
Dit protocol beschrijft een nieuwe driedimensionale in vitro model, waar hoornvlies stromale cellen en gedifferentieerde neuronale cellen samen worden gekweekt om te helpen bij het onderzoek en het begrijpen van de interacties van de twee celtypes.
Abstract
Weefselengineering heeft opgedaan grote erkenning vanwege de grote vraag voor menselijke hoornvlies vervangingen met naar schatting 10 miljoen mensen wereldwijd lijden aan hoornvlies visie verlies1. Om de vraag naar haalbare menselijke hoornvlies, aanzienlijke vooruitgang in driedimensionale (3D) weefsel engineering geboekt2,3,4. Deze hoornvlies modellen variëren van eenvoudige enkelgelaagde systemen met meerdere lagen modellen, wat leidt tot 3D full-dikte hoornvlies equivalenten2.
Echter, het gebruik van een 3D weefsel-engineered hoornvlies in het kader van de in vitro ziekte modellen studeerde tot datum ontbreekt gelijkenis met de meerdere lagen 3D hoornvlies weefsel structuur, functie en de netwerken van verschillende celtypes (d.w.z., zenuw, epitheel, stroma en endotheel)2,3. Daarnaast is de vraag naar in vitro hoornvlies weefsel modellen gestegen in een poging om het verminderen van dierproeven voor farmaceutische producten. Dus, meer verfijnde modellen zijn moeten beter aansluiten bij systemen aan menselijke fysiologische eisen, en de ontwikkeling van een model die meer relevant is voor de populatie is absoluut noodzakelijk. Gezien het feit dat meerdere celtypen in de cornea worden beïnvloed door ziekten en dystrophie, zoals Keratoconus, diabetische Keratopathy en Fuchs, bevat dit model een 3D co cultuur model van primaire menselijke hoornvlies fibroblasten (HCFs) van gezonde donoren en neuronen van de SH-SY5Y cellijn. Hierdoor kunnen we voor het eerst te onderzoeken van de interacties tussen de twee celtypes binnen de menselijke hoornvlies weefsel. Wij zijn van mening dat dit model kan potentieel het ontleden van de onderliggende mechanismen die zijn gekoppeld aan de stromale-zenuw interacties van hoornvlies ziekten die zenuw schade vertonen. Deze 3D-model komt overeen met de fundamentele anatomische en fysiologische aard van het hoornvlies weefsel in vivo en in de toekomst als een instrument kan worden gebruikt voor hoornvlies gebreken onderzoeken, alsmede het screenen van de werkzaamheid van verschillende agenten voor dierproeven.
Introduction
In het menselijk lichaam is het hoornvlies het meest dichtbevolkte bezenuwde weefsel. De zenuwen zijn verantwoordelijk voor verschillende sensaties zoals touch, pijn, temperatuur, en hebben ook een essentiële rol bij wondheling, knipperen reflexen, scheuren voor productie en afscheiding5,6,7. In het hoornvlies, stromale zenuw trunks voortvloeien uit de limbal plexus en voer de perifere hoornvlies stroma radiaal. De organisatie stromale zenuw is parallel aan de lamellen collageen en ze verder tak in kleinere werken als ze gaan naar de oppervlakkige stroma5,8. De zenuwvezels verder doordringen de epitheliale laag en dus innervatie arm grote schaal is verspreid over het hoornvlies epitheel en stroma. Innervatie arm heeft dus een essentiële rol in de gezonde en zieke toestand van het hoornvlies. We onthullen in dit protocol, de bevordering van een nieuwe 3D in vitro model, dat is de eerste van zijn soort na te bootsen de in vivo stromale-zenuw interacties. De SH-SY5Y-cellijn werd gebruikt voor deze studie, want het is een van de meest gevestigde, goed gekarakteriseerd lijnen gebruikt bij het bestuderen van de neuronale groei. De SH-SY5Y-cellijn is beschreven voor de productie van beide substraat aanhanger (S-type) en neuroblastic (N-type) cellen die transdifferentiatie9kan ondergaan. Dientengevolge, hoewel deze cellijn is afgeleid van een drievoudige opeenvolgende subclone selectie van N-type cellen, bevat het ook een klein aantal S-type cellen staat voor het ondergaan van differentiatie in neuronen met behulp van retinoic acid en hersenen-afgeleide neurotrophic factor9. Dit biedt een tool die tot een beter begrip van de cornea complicaties geassocieerd met diabetische retinopathie (DM) en andere oogbeschadigingen en/of ziekten leiden kan. Als gevolg van de moeilijkheden in verband met het verkrijgen en het kweken van neuronen van patiënten met oogbeschadigingen en/of ziekte, biedt dit model 3D in vitro aanzienlijke gevolgen voor de in de studie van de neuronale interacties en signalering met het hoornvlies stroma.
Zieke voorwaarden beïnvloeden vaak verschillende weefsels van het lichaam op zeer grote schaal, wat leidt tot een gecompromitteerde kwaliteit van leven. Oogbeschadigingen en/of dystrophie zijn algemene complicaties vaak geassocieerd met systemische ziekten en leiden tot verlies van de gezichtsscherpte of zelfs permanente visie. Uitgebreide studies zijn vaak essentieel voor een beter begrip van de toestand van de ziekte, alsmede de effecten op de basale cellulair niveau. Om te bestuderen van de effecten van deze ziekten, zijn verschillende in vivo en in vitro modellen ontwikkeld met de hulp van weefsel technische toepassingen. Hoornvlies weefsel waterbouwkundige toepassingen hebt opgeslaen belangstelling op verschillende gebieden van wetenschap10,11,12,13,14, maar er zijn nog steeds grote beperkingen tijdens concrete toepassing, met inbegrip van hoornvlies graft afwijzingen, infecties en littekens10,11,12,13,14. Er zijn verscheidene studies die hebt ontwikkeld en vastgesteld verschillende in vitro modellen3,15,16,17,18, 19,20,21,22,23,24,25,26. De 3D in vitro -modellen zijn de meest veelbelovende en van wetenschappelijke belangstelling. 3D-modellen staan bekend om beter spiegel de in vivo cellulaire en fysiologische gebeurtenissen die zijn kritische tijdens fibrose en wond genezing15,27,–28,29. Deze modellen in vitro spelen een integrale rol in het vinden van nieuwe therapeutische benaderingen voor de behandeling van verschillende ziekten met inbegrip van hoornvlies complicaties. Ondanks de kritische rol van innervatie arm in hoornvlies functies, weinig inspanning geboekt ter bevordering van de verspreiding van de perifere zenuw binnen hoornvlies weefsel-engineered constructies2,3. Echter, de voorgestelde 3D in vitro cel constructies nabootsen het doelweefsel teneinde te bereiken van de gewenste weefsel functionaliteit.
Diabetische keratopathy weliswaar een duidelijk verzoek om het model als gevolg van de neuronale gebreken die hier worden beschreven, zijn er verschillende andere hoornvlies ziekten die van een menselijke in vitro model profiteren kunnen, met inbegrip van Keratoconus en Fuchs dystrophie. Onze 3D-model komt naar voren uit dit perspectief en stelt voor de ontwikkeling van een in vitro -vertegenwoordiging van hoornvlies weefsel te beoordelen van de drug delivery en de veiligheid van nieuwe oogbeschadigingen en/of medicijnen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Verschillende studies hebben gericht geweest op de ontwikkeling van verschillende dierlijke modellen die kunnen helpen bij het ontwikkelen van een beter begrip van hoornvlies ziekten, alsook Ontdek behandelingen. Een belangrijke waarde voor de mens uit deze studies is echter niet geverifieerd. Tot op heden, zijn verschillende in vitro modellen ontwikkeld en grote schaal onderzocht vanwege hun opmerkelijke klinische betekenis. Onze eerder vastgestelde 3D in vitro model is een nieuw systeem die aanzienlij…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij willen uit te breiden onze oprechte dank aan Dr. Ben Fowler voor zijn technische hulp bij de TEM-experimenten.
Materials
| Healthy corneal tissue | NDRI | Samples from donors with no ocular trauma or systemic disease | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Solution (1X) | Gibco by Life Technologies | 14190-144 | |
| Sterile forceps | Fischer Scientific | 13-812-42 | Fisherbrand Dissecting Extra-Fine-Pointed Splinter Forceps |
| Single edge razor blades | Personna | 270100 | |
| Sterile surgical scalpel blades No.10 | Feather Surgical Blade | 2976#10 | |
| Eagle’s Minimum Essential Medium | ATCC | 30-2003 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 | 10% FBS is required for media preparation |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco by Life Technologies | 15240-062 | 1% Antibiotic-Antimycotic is required for media preparation |
| 0.05% Trypsin EDTA(1X) | Gibco by Life Technologies | 25300062 | |
| Polycarbonate membrane inserts with 0.4-μm pores | Corning Costar | 3412 | |
| 2-O-α-Dglucopyranosyl-L-ascorbic acid (Vitamin C) | Sigma-Aldrich | SMB00390-14 | A concentration of 0.5 mM should be used for the study |
| Wax block | VWR | 50-949-027 | |
| SH-SY5Y Neuroblastoma cells | ATCC | SHSY5YATCC CRL-2266 | |
| Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | SRP3014-10UG | Final concentration of 10uM needs to be used |
| BDNF | Sigma-Aldrich | R2625-100MG | Final concentration of 2nM needs to be used |
| Dimethyl Sulfoxide(DMSO) | VWR-Alfa Aesar | 67-68-5 | Ultra Pure Grade-Sterile DMSO to be used |
| Thermo Scientific Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks (T25) | Fisher Scientific | 12-565-351 | |
| Thermo Scientific Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks (T75) | Fisher Scientific | 12-565-349 |
References
- Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. Br J Ophthalmol. 96 (5), 614-618 (2012).
- Rönkkö, S., Vellonen, K. -. S., Järvinen, K., Toropainen, E., Urtti, A. Human corneal cell culture models for drug toxicity studies. Drug Delivery and Translational Research. 6 (6), 660-675 (2016).
- Ghezzi, C. E., Rnjak-Kovacina, J., Kaplan, D. L. Corneal tissue engineering: recent advances and future perspectives. Tissue Eng Part B Rev. 21 (3), 278-287 (2015).
- Shafaie, S., Hutter, V., Cook, M. T., Brown, M. B., Chau, D. Y. S. In Vitro Cell Models for Ophthalmic Drug Development Applications. BioResearch Open Access. 5 (1), 94-108 (2016).
- Shaheen, B. S., Bakir, M., Jain, S. Corneal nerves in health and disease. Surv Ophthalmol. 59 (3), 263-285 (2014).
- Beuerman, R. W., Schimmelpfennig, B. Sensory denervation of the rabbit cornea affects epithelial properties. Exp Neurol. 69 (1), 196-201 (1980).
- Heigle, T. J., Pflugfelder, S. C. Aqueous tear production in patients with neurotrophic keratitis. Cornea. 15 (2), 135-138 (1996).
- Wang, S., et al. In vitro 3D corneal tissue model with epithelium, stroma, and innervation. Biomaterials. 112, 1-9 (2017).
- Ross, R. A., Spengler, B. A., Biedler, J. L. Coordinate morphological and biochemical interconversion of human neuroblastoma cells. J Natl Cancer Inst. 71 (4), 741-747 (1983).
- Griffith, L. G., Naughton, G. Tissue engineering – Current challenges and expanding opportunities. Science. 295 (5557), (2002).
- Guo, X., et al. Morphologic characterization of organized extracellular matrix deposition by ascorbic acid-stimulated human corneal fibroblasts. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (9), 4050-4060 (2007).
- Karamichos, D. Ocular tissue engineering: current and future directions. J Funct Biomater. 6 (1), 77-80 (2015).
- Karamichos, D., Brown, R. A., Mudera, V. Collagen stiffness regulates cellular contraction and matrix remodeling gene expression. J Biomed Mater Res A. 83 (3), 887-894 (2007).
- Ruberti, J. W., Zieske, J. D. Prelude to corneal tissue engineering – gaining control of collagen organization. Prog Retin Eye Res. 27 (5), 549-577 (2008).
- Karamichos, D., Guo, X. Q., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Human corneal fibrosis: an in vitro model. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (3), 1382-1388 (2010).
- Chen, F. M., Liu, X. Advancing biomaterials of human origin for tissue engineering. Prog Polym Sci. 53, 86-168 (2016).
- Priyadarsini, S., Sarker-Nag, A., Rowsey, T. G., Ma, J. X., Karamichos, D. Establishment of a 3D In Vitro Model to Accelerate the Development of Human Therapies against Corneal Diabetes. PLoS One. 11 (12), e0168845 (2016).
- Karamichos, D., Hjortdal, J. Keratoconus: tissue engineering and biomaterials. J Funct Biomater. 5 (3), 111-134 (2014).
- Wilson, S. L., Yang, Y., El Haj, A. J. Corneal Stromal Cell Plasticity: In Vitro Regulation of Cell Phenotype Through Cell-Cell Interactions in a Three-Dimensional Model. Tissue Engineering Part A. 20 (1-2), 225-238 (2014).
- Proulx, S., et al. Reconstruction of a human cornea by the self-assembly approach of tissue engineering using the three native cell types. Molecular Vision. 16 (234-236), 2192-2201 (2010).
- Gonzalez-Andrades, M., et al. Establishment of a novel in vitro model of stratified epithelial wound healing with barrier function. Sci Rep. 6, 19395 (2016).
- Hopkins, A. M., DeSimone, E., Chwalek, K., Kaplan, D. L. 3D in vitro modeling of the central nervous system. Prog Neurobiol. 125, 1-25 (2015).
- Schulz, S., et al. Natural Corneal Cell-Based Microenvironment as Prerequisite for Balanced 3D Corneal Epithelial Morphogenesis: A Promising Animal Experiment-Abandoning Tool in Ophthalmology. Tissue Engineering Part C-Methods. 20 (4), 297-307 (2014).
- Gao, J., Wang, Y., Zhao, X., Chen, P., Xie, L. MicroRNA-204-5p-Mediated Regulation of SIRT1 Contributes to the Delay of Epithelial Cell Cycle Traversal in Diabetic Corneas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (3), 1493-1504 (2015).
- Koulikovska, M., et al. Enhanced regeneration of corneal tissue via a bioengineered collagen construct implanted by a nondisruptive surgical technique. Tissue Eng Part A. 21 (5-6), 1116-1130 (2015).
- Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Progress in retinal and eye research. 49, 17-45 (2015).
- Zieske, J. D. Extracellular matrix and wound healing. Curr Opin Ophthalmol. 12 (4), 237-241 (2001).
- Karamichos, D., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Transforming growth factor-beta3 regulates assembly of a non-fibrotic matrix in a 3D corneal model. J Tissue Eng Regen Med. 5 (8), e228-e238 (2011).
- Karamichos, D., Lakshman, N., Petroll, W. M. An experimental model for assessing fibroblast migration in 3-D collagen matrices. Cell Motil Cytoskeleton. 66 (1), 1-9 (2009).
- Karamichos, D., et al. Novel in Vitro Model for Keratoconus Disease. J Funct Biomater. 3 (4), 760-775 (2012).
